Eine zuverlässige und nützlicher Ansatz zur Histon-Modifikationen auf spezifische Pflanzen-Gene erkennen beschrieben. Der Ansatz kombiniert Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) und real-time quantitative PCR. Es ermöglicht den Nachweis von Histon-Modifikationen auf bestimmte Gene mit eine Rolle in verschiedenen physiologischen Prozessen.
Chromatin-Struktur ist für die Regulation der Genexpression in Eukaryoten wichtig. In diesem Prozess spielen die Chromatin-Remodeling, DNA-Methylierung und kovalente Modifikationen an der Amino-terminalen Enden der Histone H3 und H4 wesentliche Rollen 1-2. H3 und H4 Histon-Modifikationen zählen die Methylierung von Lysin und Arginin, Acetylierung von Lysin und Phosphorylierung von Serin-Resten 1-2. Diese Änderungen sind entweder mit Genaktivierung, Unterdrückung oder eine grundierte Stand der Gen, das eine schnellere und eine starke Aktivierung des Ausdrucks unterstützt nach Wahrnehmung der entsprechenden Signale (Mikrobe-associated molecular patterns, Licht, Hormone, etc.) 3-7 verbunden.
Hier stellen wir ein Verfahren zur zuverlässigen und empfindlichen Nachweis von spezifischen Chromatin-Modifikationen auf ausgewählte pflanzliche Gene. Die Technik basiert auf der Vernetzung von (modifizierten) Histone und DNA mit Formaldehyd 8,9, Extraktion und Beschallung von Chromatin, Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) mit Modifikation-spezifische Antikörper 9,10 basiert, de-Vernetzung von Histon-DNA-Komplexe und Gen-spezifischen real-time quantitative PCR. Der Ansatz hat sich zum Nachweis von spezifischen Histon-Modifikationen mit C 4 Photosynthese in Mais 5,11 und systemische Immunität in Arabidopsis 3 zugeordnet nützlich.
Die meisten kritischen Schritte in dem Protokoll sind die Vernetzung von DNA und Histonen, die Art und Menge der Blattmaterial, Schleifen des Materials und die Beschallung von Chromatin. Für eine detailliertere Erörterung dieser Probleme finden Sie unter refs. 9 und 10.
Beschallung und Vernetzung:
Es ist wichtig, Chromatin während der Beschallung auf Fragmente von ca. 400bp zu stören. Dank intensiver Beschallung wird Chromatin durch Unterbrechung der DNA und Histonen zu zerstören, während unzureichende Beschallung lange Chromatinfragmenten verlassen wird. Diese beeinflussen die Spezifität der Methode, weil Histon-Modifikationen distal von den getesteten locus keine lokalen Änderungen benachteiligt werden. Beschallung Effizienz am besten durch das Sammeln von 20 &mgr; l Chromatin von Proben vor und nach Beschallung, de-Vernetzung DNA und Histonen, Isolierung der DNA und die Bestimmung der Länge der DNA geschert durch Agarosegelelektrophorese überprüft. RNAse sollte, um die Proben vor der Elektrophorese hinzugefügt werden, da das Chromatin Vorbereitung enthält noch große Mengen an RNA in diesem Stadium der Reinigung, die mit der Visualisierung von fragmentierten DNA stören könnten. Die Proben werden für Chromatinimmunpräzipitation nützlich, wenn DNA aus nicht geschert Chromatin ist länger als 10kbp, während DNA aus geschert Chromatin bildet ein Abstrich mit maximaler Signalstärke um 400bp DNA.
Wir verwenden routinemäßig 3% (v / v) Formaldehyd für Chromatin Vernetzung in intakten Blättern, aber 1% (v / v) Formaldehyd könnte in den meisten Fällen ausreichend. In unsere Hände, damit eine niedrige Formaldehyd-Konzentrationen für kürzere Zeiten Beschallung und Hintergrund-Signale in Folge PCR-Reaktionen. Allerdings, unzureichende Mengen an Formaldehyd oft in geringen Reproduzierbarkeit der PCR-Signal zwischen unabhängigen Experimenten führen. Dies könnte durch unzureichende Durchdringung der Blätter mit Formaldehyd bei niedrigen Konzentrationen. Achten Sie auf Ihre Formaldehyd Lager häufig austauschen, wie die Verbindung neigt dazu, sich mit der Zeit polymerisieren. Formaldehyd-Lösungen sind nur für etwa einen Monat stabil, und diese Zeit ist kaum von Methanol Stabilisierung verlängert. Es wird empfohlen, verschiedene Formaldehyd-Konzentrationen Test beim Einrichten experimentellen Bedingungen.
Betrag von Pflanzenmaterial und Schleifen:
Es ist wichtig zu geringe Mengen an Blattmaterial in einem großen Volumen an Puffer zu infiltrieren, um Blätter aneinander kleben zu vermeiden. Blatt kleben oft in unzureichender Infiltration von Formaldehyd. Darüber hinaus wird zu viel Pflanzenmaterial Block Poren der Miracloth Gewebe. Die Mahleffizienz hängt wesentlich mit einem Mörser und Stößel mit einer perfekten Passform. Wir routinemäßig mahlen mit flüssigem Stickstoff gekühlten Mörser in Abwesenheit von zusätzlichen flüssigen Stickstoff dreimal für 50 Sekunden, bis das Material zu einem feinen Pulver gemahlen wird.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) und der Exzellenzinitiative der deutschen Bundesregierung und der Länder gefördert.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Yorumlar |
---|---|---|---|
Protein-A-Agarose | Roche | 11 134 515 001 | depends on the antibody class |
Protein-G-Agarose | Roche | 11 243 233 001 | depends on the antibody class |
Anti-hyperacetyl-H4 | Millipore | 06-946 | we used 5μL |
Anti-acetyl-H4K5 | Millipore | 07-327 | we used 5μL |
Anti-acetyl-H4K8 | Millipore | 07-328 | we used 5μL |
Anti-acetyl-H4K12 | Millipore | 07-595 | we used 5μL |
Anti-acetyl-H4K16 | Millipore | 07-329 | we used 5μL |
Anti-acetyl-H4K18 | Millipore | 07-354 | we used 1μL |
Anti-acetyl-H3K9 | Millipore | 07-352 | we used 5μL |
Anti-acetyl-H3K14 | Millipore | 07-353 | we used 1μL |
Anti-trimethyl-H3K4 | Diagenode | pAB-003-50 | we used 5μL |
Anti-dimethyl-H3K4 | Millipore | 07-030 | we used 5μL |
Anti-monomethyl-H3K4 | Abcam | ab8895 | 2,5 -10μL |
Anti-H3 | Abcam | ab1791 | we used 1μL to check histone density |
Bioruptor | Diagenode | UCD-200 TO | |
Sonotrode MS72 | Bandelin | ||
Miracloth | Calbiochem | 475855 | |
Complete Protease Inhibitor | Roche | 11836145001 |