Un enfoque confiable y útil para detectar modificaciones de las histonas en los genes específicos de la planta se describe. El enfoque combina la cromatina immunoprecipitation (CHIP) y en tiempo real PCR cuantitativa. Que permite la detección de modificaciones de las histonas en los genes específicos con un papel en diversos procesos fisiológicos.
Estructura de la cromatina es importante para la regulación de la expresión génica en las células eucariotas. En este proceso, las modificaciones de remodelación de la cromatina, la metilación del ADN, y covalentes en las colas amino-terminal de las histonas H3 y H4 juegan un papel esencial 1-2. Modificaciones de histonas H3 y H4 incluyen la metilación de la lisina y la arginina, la acetilación de la lisina, y la fosforilación de 1-2 residuos de serina. Estas modificaciones se relacionan tanto con la activación de genes, la represión, o en un estado preparado de gen que admite la activación más rápida y robusta de expresión después de la percepción de las señales apropiadas (microbio patrones moleculares asociados, la luz, hormonas, etc) 3-7.
A continuación, presentamos un método para la detección fiable y sensible de determinadas modificaciones de la cromatina en los genes de plantas seleccionadas. La técnica se basa en el entrecruzamiento de (modificar) las histonas y el ADN con formaldehído 8,9, extracción y tratamiento con ultrasonidos de la cromatina, cromatina immunoprecipitation (CHIP) con la modificación de los anticuerpos específicos de 9,10, de reticulación de la histona-ADN complejos, y de genes específicos en tiempo real PCR cuantitativa. El enfoque ha demostrado ser útil para la detección de modificaciones de las histonas específicas asociadas a la fotosíntesis C 4 en el maíz 5,11 y la inmunidad sistémica en Arabidopsis 3.
Pasos más importantes en el protocolo son el entrecruzamiento de ADN y las histonas, el tipo y cantidad de material de la hoja, la molienda de la materia, y la sonicación de la cromatina. Para una discusión más detallada de estos temas, ver refs. 9 y 10.
Sonicación y el entrecruzamiento:
Es importante para interrumpir la cromatina durante la sonicación a los fragmentos de alrededor de 400bp. Sonicación exhaustiva va a destruir la cromatina mediante la interrupción de ADN y las histonas, mientras que la sonicación insuficiente dejará largos fragmentos de la cromatina. Estos afectan a la especificidad del método, porque las modificaciones de las histonas distal del locus pruebas no pueden ser discriminados de modificaciones locales. La eficiencia es la mejor prueba de sonicación mediante la recopilación de la cromatina 20μL de las muestras antes y después del tratamiento con ultrasonidos, de reticulación del ADN y las histonas, aislando el ADN y la determinación de la longitud del ADN cortado por electroforesis en gel de agarosa. RNAsa debe ser añadido a las muestras antes de la electroforesis, ya que la preparación de la cromatina todavía contiene grandes cantidades de ARN en esta etapa de purificación que pueda interferir con la visualización de ADN fragmentado. Las muestras son útiles para la inmunoprecipitación de cromatina si el ADN de la cromatina no esquilada es más largo que 10kbp, mientras que el ADN de la cromatina cortado formas una prueba con una intensidad máxima de la señal alrededor de 400bp de ADN.
Nosotros usamos el 3% (v / v) de formaldehído para la reticulación de la cromatina en hojas intactas, pero el 1% (v / v) de formaldehído puede ser suficiente en la mayoría de los casos. En nuestras manos, las bajas concentraciones de formaldehído permitir tiempos de sonicación más cortos y las señales de fondo en la consiguiente reacción de PCR. Sin embargo, una cantidad insuficiente de formaldehído a menudo resultan en una baja reproducibilidad de la señal de PCR entre experimentos independientes. Esto puede ser debido a la penetración insuficiente de las hojas con formaldehído en concentraciones bajas. Asegúrese de que el intercambio de sus acciones de formaldehído con frecuencia como el compuesto tiende a polimerizar con el tiempo. Las soluciones de formaldehído son estables sólo durante aproximadamente un mes, y esta época no es prolongada por la estabilización de metanol. Se recomienda probar diferentes concentraciones de formaldehído en la creación de condiciones experimentales.
Cantidad de material vegetal y de molienda:
Es importante para infiltrar pequeñas cantidades de material de la hoja en un gran volumen de tampón para evitar que las hojas se peguen entre sí. Hoja se pegue a menudo resulta en la infiltración insuficiente de formaldehído. Además, el material vegetal demasiada bloquear los poros del tejido Miracloth. La eficiencia de la molienda depende considerablemente en el uso de un mortero con el ajuste perfecto. En forma rutinaria molienda con un nitrógeno líquido refrigerado mortero en la ausencia de nitrógeno líquido adicional de tres veces durante 50 segundos hasta que el material se muele hasta obtener un polvo fino.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue financiado por la Fundación Alemana para la Ciencia (DFG) y la Iniciativa de Excelencia de los gobiernos de Alemania federal y estatal.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Yorumlar |
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Protein-A-Agarose | Roche | 11 134 515 001 | depends on the antibody class |
Protein-G-Agarose | Roche | 11 243 233 001 | depends on the antibody class |
Anti-hyperacetyl-H4 | Millipore | 06-946 | we used 5μL |
Anti-acetyl-H4K5 | Millipore | 07-327 | we used 5μL |
Anti-acetyl-H4K8 | Millipore | 07-328 | we used 5μL |
Anti-acetyl-H4K12 | Millipore | 07-595 | we used 5μL |
Anti-acetyl-H4K16 | Millipore | 07-329 | we used 5μL |
Anti-acetyl-H4K18 | Millipore | 07-354 | we used 1μL |
Anti-acetyl-H3K9 | Millipore | 07-352 | we used 5μL |
Anti-acetyl-H3K14 | Millipore | 07-353 | we used 1μL |
Anti-trimethyl-H3K4 | Diagenode | pAB-003-50 | we used 5μL |
Anti-dimethyl-H3K4 | Millipore | 07-030 | we used 5μL |
Anti-monomethyl-H3K4 | Abcam | ab8895 | 2,5 -10μL |
Anti-H3 | Abcam | ab1791 | we used 1μL to check histone density |
Bioruptor | Diagenode | UCD-200 TO | |
Sonotrode MS72 | Bandelin | ||
Miracloth | Calbiochem | 475855 | |
Complete Protease Inhibitor | Roche | 11836145001 |