살아있는 동물 이내에 줄기 세포 차별을 공부에 대한 매력적인 모델은 planarian의 flatworm입니다. 재생 쉽게 기본적인 실험실에서 수행하는 간단한 절단 실험에서 공부하고 약리 및 유전 (의무뿐입니다<em> 생체내에</em> RNAi)이 문서의 프로토콜에 의해 내용으로 조작.
자유 생활 planarian의 flatworms 자신의 뛰어난 재생 능력을 1로 실험적인 사용 때문에 오랜 역사를 가지고. 이 동물에서 excised 작은 조각이 없거나 신체 구조의 재생 다음 원래 신체 계획을 개혁. '트렁크'조각이 손상 웜으로부터자를 경우 예를 들어, 새 '머리'anteriorly 재생되며, '꼬리'는 (그림 절단하기 전에 원래의 신체 구조의 '머리 – 투 – 꼬리'극성을 복원 뒤로 재생성합니다 1A).
재생 정상 신체 항상성 및 집행 조직 재생 중에 ~ 30 서로 다른 세포 유형으로 차별 'neoblasts'로 알려진 planarian 줄기 세포에 의해 구동됩니다. 이 재생 과정은 강력하고 입증하기 쉽습니다. 여러 선구 실험실, 다양한 도구와 기능 유전 방법의 헌신에 때문에 지금은이 모델을 시스템에 최적화된되었습니다. 따라서, 상당한 최근의 진전은 planarian 발달 소성 2-9을 underpinning 분자 이벤트를 이해하고 조작하였습니다.
planarian 모델 시스템은 과학자들의 광범위한 관심을 것입니다. neuroscientists 들어, 모델은 전체 신경계의 재생을 연구보다는 단순히 regrowth / 일반적으로 많이 설립 모델에 연구의 초점 아르 단일 신경 세포 프로세스의 복구합니다. 수있는 기회를 내실수 Planarians는 신경 전달 물질 10 과다을 표현 중추 신경계 11, 12의 진화를 연구를위한 중요한 시스템을 대표하고 행동 선별 가능성 13, 14 있습니다.
재생 결과는 약리 및 유전자 조작에 의해 apparoaches 의무가 있습니다. 예를 들어, 약물 단순히 몸과 조각을 배치 약물이 포함된 절단 후 다른 시간 지점에서 솔루션을하여 재생에 대한 효과에 대한 심사 수 있습니다. 개별 유전자의 역할은 microinjection의 사이클이나 dsRNA 구조 8, 9, 15 bacterially – 표현 이송을 통해 얻을 수있는 최저의 방법을 (생체내 RNAi)를 이용하여 공부하실 수 있습니다. 두 방식은 바이폴라 동물 16-21 높은 penetrance – 예를 들어, 재생시 시각적으로 눈에 띄는 phenotypes를 만들 수 있습니다. 이 모델과 같은 방법을 구현 채택을 촉진하기 위하여, 우리는 planarian의 Dugesia가 자포니카 사용 약리 및 유전 assays (생체내 RNAi의 먹이에 의해)이 동영상 기사 프로토콜의 쇼케이스.
프로토콜은 자포니카 planarian의 Dugesia의 재생을 연구하고 조작 여기 상세 assays을 설명했다. 그들은 간단하고 쉽게 실험실이나 교실에서 수행할 수있는 전문 장비가 이러한 요구하지 않습니다. Assays 개별적으로 수행하거나, 결합 (생체내에서 마약 efficacies의 화학 유전자 검사)와 후보 유전자 수준에서 수행할 수 있습니다, 또는 불편, 높은 처리량 검사 8 적응력이 아르 수 있습니다. 자신의 권리를 planarians의 흥미로운 생물학을 공부에 대한 여부, 또는 조직 재생을 연구에 대한 대안 모델의 포유 동물 homologues의 생체내 기능의 평가에 대한 이러한 접근 방식은 연구자의 다양한에서 관심을 catalyze해야합니다.
The authors have nothing to disclose.
실험실에서 작업은 NSF (MCB0919933)와 NIH (GM088790)에 의해 지원됩니다.
Reagent | Vendor | Catalogue Number | Yorumlar |
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Spring water | Kandiyohi. Premium Waters Inc. Minneapolis, MN | n/a | Other forms of spring water work well also. Trial first in viability assays. |
1 x buffered Montjuïch salts: NaCl (1.6mM), CaCl2 (1mM), MgSO4 (1mM), MgCl2 (0.1mM), KCl (0.1mM), NaHCO3 (1.2mM), HEPES (1.5mM). pH 7.4 at 24°C. | Multiple vendors | n/a | Artificial water for drug treatments during regenerative assays to ensure pH buffering. 5/8 Holtfreter’s solution is an alternative. |
2xYT Broth | Fisher Scientific | BP2467-500 | Media = 31 g/L . Autoclaved. |
Petri Dish (100x25mm) | Fisher Scientific | 08-757-11 | Housing worms during regeneration cycles |
Square Dish (100x100x15mm) | Fisher Scientific | 08-757-11A | Fill with water, freeze for ice tray used as worm cutting surface |
Plastic tub: Ziploc Twist ‘n Loc (16oz). | Various retailers | n/a | Convenient water tight containers for RNAi cohorts |
Chicken Liver | Commercial grocery | n/a | Bias towards organic supplies, owing to avoidance of antibiotics. |
Hand Blender | Any kitchen supplier | n/a | Use for making chicken liver puree |
Wire 1mm Mesh strainer | Any kitchen supplier | n/a | Use for straining chicken liver puree |
Bovine red blood cells | Lampire Biological Laboratories | 7240807 | 100% Washed and pooled RBC suspension |
Circular filter papers | Whatman #3 | 1003 055 | |
Transfer Pipette | Fisher Scientific | 13-711-41 | |
Sterile, surgical blades | Multiple Vendors | n/a | |
±Praziquantel | Sigma Aldrich | P4668 | Store powder aliquots in the dark at 4°C. Desiccate. |
Dj-six-1 | GenBank AJ557022.1 | RNAi positive control for “eye-less” phenotype23 | |
Dj-βcatenin-1 | GenBank AB181913.1 | RNAi positive control for two-headed phenotype17 | |
Dj-PC2 | RNAi positive control for loss of light aversion phenotype24 |