在一个活的动物研究干细胞分化的一个有吸引力的模式是涡虫扁虫。再生是由简单的截肢手术,很容易在一个基本的实验室进行的实验研究和药理学和基因(适合<em>在体内</em> RNAi)的操纵,在这篇文章中的协议详细。
自由生活涡虫扁虫有一个历史悠久的实验使用,因为他们非凡的再生能力 1 。从这些动物切除的小片断,改革原体计划,缺少的车身结构的再生。例如,如果一个“主干”的片段是从一个完整的蠕虫切割,一个新的“头”将再生前方一个“尾巴”后方将重新恢复了原有的“头部到尾部的车身结构的极性截肢前(图1A)。
涡虫被称为“neoblasts'〜30种不同类型的细胞分化,在正常的身体动态平衡和执行组织再生的干细胞,是由再生。这种再生过程是可靠和容易证明。由于几个创业实验室,许多工具和功能基因的方法的奉献精神,现在已经为这个模型系统进行了优化。因此,相当最近已经取得了进展,在理解和操作基础 2-9涡虫的发育可塑性的分子事件。
涡模型系统将会以一个科学家的广泛利益。神经学家,模型给予机会研究整个神经系统的再生,而不是简单的再生/修复单个神经细胞的过程中,通常是在许多已建立的模型研究的重点。涡虫表达的神经递质10过多,代表的一项重要制度,为研究中枢神经系统的11,12的演变,行为甄别潜在的13,14 。
再生的结果是经得起药理和遗传apparoaches操纵。例如,可以进行筛选药物对再生的影响,只需放置在身体片段的药物含截肢后在不同时间点的解决方案。使用击倒方法( 在体内的RNAi),这可以实现,通过显微注射周期或喂食细菌表达双链RNA的结构8,9,15,可以研究单个基因的作用。这两种方法都可以产生高外显率,例如,双极动物16-21再生的视觉冲击的表型。为了便于采用这种模式和实施这种方法,我们将展示使用涡虫日本三角涡虫的药理学和基因检测(在体内RNAi技术通过喂食)的视频在这条协议。
这里描述协议详细分析,研究和操纵涡虫三角涡虫再生的粳稻。他们很简单,不需要专用设备等,他们可以很容易地在实验室或教室进行。分析可以单独进行,或合并化学药物药效在体内的基因筛查,可以在候选基因水平上进行,或适应无偏见的,高通量筛选 8 。无论是耐人寻味的涡虫的生物学研究自己的权利,或在体内功能在哺乳动物的同源性研究组织再生的替代模型的评估,这些方法应推动多元化的研究人员的兴趣。
The authors have nothing to disclose.
在实验室的工作是由NSF(MCB0919933)和国立卫生研究院(GM088790)的支持。
Reagent | Vendor | Catalogue Number | Yorumlar |
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Spring water | Kandiyohi. Premium Waters Inc. Minneapolis, MN | n/a | Other forms of spring water work well also. Trial first in viability assays. |
1 x buffered Montjuïch salts: NaCl (1.6mM), CaCl2 (1mM), MgSO4 (1mM), MgCl2 (0.1mM), KCl (0.1mM), NaHCO3 (1.2mM), HEPES (1.5mM). pH 7.4 at 24°C. | Multiple vendors | n/a | Artificial water for drug treatments during regenerative assays to ensure pH buffering. 5/8 Holtfreter’s solution is an alternative. |
2xYT Broth | Fisher Scientific | BP2467-500 | Media = 31 g/L . Autoclaved. |
Petri Dish (100x25mm) | Fisher Scientific | 08-757-11 | Housing worms during regeneration cycles |
Square Dish (100x100x15mm) | Fisher Scientific | 08-757-11A | Fill with water, freeze for ice tray used as worm cutting surface |
Plastic tub: Ziploc Twist ‘n Loc (16oz). | Various retailers | n/a | Convenient water tight containers for RNAi cohorts |
Chicken Liver | Commercial grocery | n/a | Bias towards organic supplies, owing to avoidance of antibiotics. |
Hand Blender | Any kitchen supplier | n/a | Use for making chicken liver puree |
Wire 1mm Mesh strainer | Any kitchen supplier | n/a | Use for straining chicken liver puree |
Bovine red blood cells | Lampire Biological Laboratories | 7240807 | 100% Washed and pooled RBC suspension |
Circular filter papers | Whatman #3 | 1003 055 | |
Transfer Pipette | Fisher Scientific | 13-711-41 | |
Sterile, surgical blades | Multiple Vendors | n/a | |
±Praziquantel | Sigma Aldrich | P4668 | Store powder aliquots in the dark at 4°C. Desiccate. |
Dj-six-1 | GenBank AJ557022.1 | RNAi positive control for “eye-less” phenotype23 | |
Dj-βcatenin-1 | GenBank AB181913.1 | RNAi positive control for two-headed phenotype17 | |
Dj-PC2 | RNAi positive control for loss of light aversion phenotype24 |