Un modello interessante per studiare la differenziazione delle cellule staminali in un animale vivo è il verme piatto planaria. La rigenerazione è studiato da amputazione esperimenti semplici che sono facili da eseguire in un laboratorio di base e sono suscettibili di (farmacologica e genetica<em> In vivo</em> RNAi) manipolazione come descritto dai protocolli in questo articolo.
A vita libera planaria vermi piatti hanno una lunga storia di causa dell'utilizzo sperimentale della loro notevoli capacità rigenerative 1. Piccoli frammenti prelevati da questi animali riformare il piano originale corpo dopo la rigenerazione delle strutture del corpo mancanti. Per esempio se frammento di un 'tronco' viene tagliato da un worm intatta, la 'testa' di un nuovo rigenererà anteriormente e una 'coda' rigenererà posteriormente ripristinare l'originaria polarità 'testa-coda' delle strutture del corpo prima amputazione (Figura 1A).
La rigenerazione è guidato da cellule staminali planaria, noto come 'neoblasts', che si differenziano in circa 30 diversi tipi di cellule normali del corpo durante l'omeostasi e la rigenerazione dei tessuti applicati. Questo processo rigenerativo è robusto e facile da dimostrare. Grazie alla dedizione di alcuni laboratori d'avanguardia, molti strumenti e metodi di genetica funzionale sono stati ottimizzati per questo sistema modello. Di conseguenza, notevoli recenti progressi sono stati fatti nella comprensione e manipolare gli eventi molecolari alla base planaria plasticità dello sviluppo 2-9.
Il sistema modello planaria sarà di interesse per una vasta gamma di scienziati. Per i neuroscienziati, il modello offre l'opportunità di studiare la rigenerazione di un intero sistema nervoso, piuttosto che semplicemente la ricrescita / riparazione del singolo processo delle cellule nervose che normalmente sono oggetto di studio in molti modelli consolidati. Planarie esprimere una pletora di neurotrasmettitori 10, rappresentano un importante sistema per lo studio dell'evoluzione del sistema nervoso centrale 11, 12 e hanno un potenziale di screening comportamentale 13, 14.
Risultati rigenerativa sono suscettibili di manipolazione da parte apparoaches farmacologiche e genetiche. Per esempio, i farmaci possono essere sottoposti a screening per gli effetti sulla rigenerazione semplicemente inserendo frammenti di corpo in soluzioni contenenti farmaci in diversi momenti dopo l'amputazione. Il ruolo dei singoli geni possono essere studiati utilizzando metodi knockdown (RNAi in vivo), che può essere realizzato attraverso cicli di microiniezione o alimentando batteri-espresso costruisce dsRNA 8, 9, 15. Entrambi gli approcci possono produrre fenotipi di grande impatto visivo ad alta penetranza, ad esempio, la rigenerazione degli animali bipolare 16-21. Per facilitare l'adozione di questo modello e implementazione di tali metodi, che in vetrina protocolli articolo il video per le analisi farmacologiche e genetiche (RNAi in vivo per l'alimentazione) utilizzando il Dugesia planaria japonica.
I protocolli descritti dettagliatamente i test per lo studio e la manipolazione di rigenerazione della planaria Dugesia japonica. Sono semplici e non richiedono attrezzature specializzate tale da poter essere facilmente eseguito in laboratorio o in aula. Test può essere effettuato singolarmente o combinate (per lo screening genetico chimica dell'efficacia dei farmaci in vivo) e può essere eseguita a livello del gene candidato, o sono adattabili a imparziali, screening ad alto 8. Sia per lo studio della biologia intrigante di planarie in sé, o per la valutazione della funzione in vivo di omologhi mammiferi in un modello alternativo per studiare la rigenerazione dei tessuti, questi approcci dovrebbero catalizzare l'interesse di una vasta gamma di ricercatori.
The authors have nothing to disclose.
Lavoro in laboratorio è supportato da NSF (MCB0919933) e NIH (GM088790).
Reagent | Vendor | Catalogue Number | Yorumlar |
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Spring water | Kandiyohi. Premium Waters Inc. Minneapolis, MN | n/a | Other forms of spring water work well also. Trial first in viability assays. |
1 x buffered Montjuïch salts: NaCl (1.6mM), CaCl2 (1mM), MgSO4 (1mM), MgCl2 (0.1mM), KCl (0.1mM), NaHCO3 (1.2mM), HEPES (1.5mM). pH 7.4 at 24°C. | Multiple vendors | n/a | Artificial water for drug treatments during regenerative assays to ensure pH buffering. 5/8 Holtfreter’s solution is an alternative. |
2xYT Broth | Fisher Scientific | BP2467-500 | Media = 31 g/L . Autoclaved. |
Petri Dish (100x25mm) | Fisher Scientific | 08-757-11 | Housing worms during regeneration cycles |
Square Dish (100x100x15mm) | Fisher Scientific | 08-757-11A | Fill with water, freeze for ice tray used as worm cutting surface |
Plastic tub: Ziploc Twist ‘n Loc (16oz). | Various retailers | n/a | Convenient water tight containers for RNAi cohorts |
Chicken Liver | Commercial grocery | n/a | Bias towards organic supplies, owing to avoidance of antibiotics. |
Hand Blender | Any kitchen supplier | n/a | Use for making chicken liver puree |
Wire 1mm Mesh strainer | Any kitchen supplier | n/a | Use for straining chicken liver puree |
Bovine red blood cells | Lampire Biological Laboratories | 7240807 | 100% Washed and pooled RBC suspension |
Circular filter papers | Whatman #3 | 1003 055 | |
Transfer Pipette | Fisher Scientific | 13-711-41 | |
Sterile, surgical blades | Multiple Vendors | n/a | |
±Praziquantel | Sigma Aldrich | P4668 | Store powder aliquots in the dark at 4°C. Desiccate. |
Dj-six-1 | GenBank AJ557022.1 | RNAi positive control for “eye-less” phenotype23 | |
Dj-βcatenin-1 | GenBank AB181913.1 | RNAi positive control for two-headed phenotype17 | |
Dj-PC2 | RNAi positive control for loss of light aversion phenotype24 |