Un modèle intéressant pour étudier différenciation des cellules souches au sein d'un animal vivant est le ver plat planaire. La régénération est étudiée par des expériences simples amputations qui sont facilement réalisées dans un laboratoire de base et sont susceptibles d'être (pharmacologiques et génétiques<em> In vivo</em> ARNi) de manipulation tel que détaillé par des protocoles dans cet article.
Plathelminthes planaire libre-vivants ont une longue histoire d'utilisation en raison de leurs remarquables expérimentale capacités régénératrices 1. De petits fragments excisés de ces animaux de réforme au plan du corps d'origine après la régénération des structures du corps manquant. Par exemple, si un fragment «tronc» est coupé à partir d'un ver intacts, «tête» d'une nouvelle va régénérer en avant et une «queue» se régénère arrière restaurer l'original de polarité «tête-à-queue» des structures du corps avant l'amputation (figure 1A).
La régénération est tirée par les cellules souches planaire, connu comme 'néoblastes »qui se différencient en ~ 30 différents types de cellules lors de l'homéostasie normale du corps et la régénération tissulaire appliquée. Ce processus de régénération est robuste et facile à démontrer. Grâce au dévouement de plusieurs laboratoires de pionnier, de nombreux outils et méthodes de génétique fonctionnelle ont été optimisés pour ce système modèle. Par conséquent, des progrès considérables ces dernières ont été réalisés dans la compréhension et la manipulation des événements moléculaires qui sous-tend planaire plasticité développementale 2-9.
Le système modèle planaire sera d'intérêt pour un large éventail de scientifiques. Pour les neuroscientifiques, le modèle offre la possibilité d'étudier la régénération d'un système nerveux entier, plutôt que de simplement la repousse / réparation des cellules nerveuses du processus unique qui sont généralement l'objet d'études dans de nombreux modèles établis. Planaires exprimer une multitude de neurotransmetteurs 10, représentent un système important pour étudier l'évolution du système nerveux central 11, 12 et ont un potentiel de dépistage comportementale 13, 14.
Régénérative résultats se prêtent à la manipulation par apparoaches pharmacologiques et génétiques. Par exemple, les médicaments peuvent être criblés pour les effets sur la régénération, simplement en plaçant des fragments de corps à la drogue contenant des solutions à différents moments après l'amputation. Le rôle des gènes individuels peuvent être étudiés en utilisant des méthodes knockdown (ARNi in vivo), qui peut être atteint soit par des cycles de micro-injection ou par l'alimentation des bactéries-exprimé construit ARNdb 8, 9, 15. Les deux approches peuvent produire des phénotypes visuellement frappant au-pénétrance de haute, par exemple, la régénération des animaux bipolaires 16-21. Afin de faciliter l'adoption de ce modèle et l'application de telles méthodes, nous présentons dans cet article la vidéo protocoles pour les essais pharmacologiques et génétiques (ARNi in vivo par l'alimentation) en utilisant le Dugesia planaire japonica.
Les protocoles décrits ici en détail des essais pour étudier et manipuler la régénération de la planaire Dugesia japonica. Elles sont simples et ne nécessitent pas de matériel spécialisé tel qu'ils peuvent être facilement réalisées en laboratoire ou en classe. Les dosages peuvent être effectués individuellement ou combinés (pour le dépistage génétique des produits chimiques des efficacités médicament videodan vivo) et peut être effectuée au niveau du gène candidat, ou sont adaptables à impartiales, dépistage du débit plus élevé 8. Que ce soit pour étudier la biologie fascinante des Planaires dans leur propre droit, ou pour évaluer la fonction in vivo des homologues de mammifères dans un modèle alternatif pour l'étude de la régénération des tissus, ces approches devraient catalyser l'intérêt d'un large éventail de chercheurs.
The authors have nothing to disclose.
Le travail en laboratoire est soutenu par la NSF (MCB0919933) et le NIH (GM088790).
Reagent | Vendor | Catalogue Number | Yorumlar |
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Spring water | Kandiyohi. Premium Waters Inc. Minneapolis, MN | n/a | Other forms of spring water work well also. Trial first in viability assays. |
1 x buffered Montjuïch salts: NaCl (1.6mM), CaCl2 (1mM), MgSO4 (1mM), MgCl2 (0.1mM), KCl (0.1mM), NaHCO3 (1.2mM), HEPES (1.5mM). pH 7.4 at 24°C. | Multiple vendors | n/a | Artificial water for drug treatments during regenerative assays to ensure pH buffering. 5/8 Holtfreter’s solution is an alternative. |
2xYT Broth | Fisher Scientific | BP2467-500 | Media = 31 g/L . Autoclaved. |
Petri Dish (100x25mm) | Fisher Scientific | 08-757-11 | Housing worms during regeneration cycles |
Square Dish (100x100x15mm) | Fisher Scientific | 08-757-11A | Fill with water, freeze for ice tray used as worm cutting surface |
Plastic tub: Ziploc Twist ‘n Loc (16oz). | Various retailers | n/a | Convenient water tight containers for RNAi cohorts |
Chicken Liver | Commercial grocery | n/a | Bias towards organic supplies, owing to avoidance of antibiotics. |
Hand Blender | Any kitchen supplier | n/a | Use for making chicken liver puree |
Wire 1mm Mesh strainer | Any kitchen supplier | n/a | Use for straining chicken liver puree |
Bovine red blood cells | Lampire Biological Laboratories | 7240807 | 100% Washed and pooled RBC suspension |
Circular filter papers | Whatman #3 | 1003 055 | |
Transfer Pipette | Fisher Scientific | 13-711-41 | |
Sterile, surgical blades | Multiple Vendors | n/a | |
±Praziquantel | Sigma Aldrich | P4668 | Store powder aliquots in the dark at 4°C. Desiccate. |
Dj-six-1 | GenBank AJ557022.1 | RNAi positive control for “eye-less” phenotype23 | |
Dj-βcatenin-1 | GenBank AB181913.1 | RNAi positive control for two-headed phenotype17 | |
Dj-PC2 | RNAi positive control for loss of light aversion phenotype24 |