Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) wurden als wesentliche Technik, um Bild die Umwelt und die Interaktion bestimmter Proteine und Farbstoffe, die in lebenden Zellen entstanden. FLIM fluoreszierender molekularer Rotoren ermöglicht die Zuordnung der Viskosität in lebenden Zellen.
Diffusion ist oft ein wichtiger geschwindigkeitsbestimmende Schritt in chemischen Reaktionen oder biologische Prozesse und spielt eine Rolle in einer Vielzahl von intrazellulären Ereignissen. Die Viskosität ist einer der wichtigsten Parameter, die die Diffusion von Molekülen und Proteinen, und Änderungen in der Viskosität haben, um Krankheit und Störung wurde auf zellulärer Ebene verknüpft. 3.1 Während Methoden, um die Masse zu messen Viskosität gut entwickelt sind, bleibt eine Herausforderung Bildgebung Mikroviskosität . Viskosität Karten von mikroskopisch kleinen Objekten, wie einzelne Zellen, haben bis vor kurzem noch schwer zu bekommen. Mapping Viskosität mit Fluoreszenz-Verfahren ist vorteilhaft, da, ähnlich wie bei anderen optischen Techniken, es minimal-invasiven, nicht-destruktiv ist und kann an lebenden Zellen und Geweben angewandt werden.
Fluoreszierende molekularer Rotoren weisen Fluoreszenzlebensdauern und Quantenausbeuten, die eine Funktion der Viskosität ihrer Mikroumgebung sind. 4,5 Intramolekulare Verdrehen oderDrehung führt zu nicht-strahlenden Zerfall aus dem angeregten Zustand zurück in den Grundzustand. Ein viskoser Umwelt verlangsamt diese Rotation oder Verdrehung, die den Zugang zu dieser nicht-strahlenden Zerfall Weg. Dies führt zu einer Erhöhung der Fluoreszenz-Quantenausbeute und der Fluoreszenzlebensdauer. Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) von modifizierten hydrophoben BODIPY Farbstoffe, die als fluoreszierende molekulare Rotoren wirken zeigen, dass die Fluoreszenz-Lebensdauer dieser Sonden eine Funktion der Mikroviskosität ihrer Umgebung ist. 8.6 eine logarithmische Darstellung der Fluoreszenz-Lebensdauer im Vergleich zu den Lösungsmittelviskosität Erträge eine gerade Linie, die die Förster Hoffman Gleichung gehorcht. 9 Dieses Grundstück dient auch als Eichkurve zur Fluoreszenz-Lebensdauer in Viskosität zu konvertieren.
Nach der Inkubation von lebenden Zellen mit dem modifizierten BODIPY fluoreszierende molekulare Rotor wird eine punktförmige Verteilung in den Farbstoff Fluoreszenz-Bildern beobachtet. Die Viskosität Wert in th erhaltene puncta in lebenden Zellen ist etwa 100 mal höher als die von Wasser und Zytoplasma. 6,7 Zeitaufgelöste Fluoreszenzanisotropiemessungen nachgeben Rotationskorrelationszeiten im Einvernehmen mit diesen großen Mikroviskosität Werte. Zuordnen der Fluoreszenz-Lebensdauer ist unabhängig von der Intensität der Fluoreszenz, und ermöglicht somit die Trennung der Sonde Konzentration und Viskosität Effekte.
Zusammenfassend haben wir eine praktische und vielseitige Herangehensweise an die Mikroviskosität in Zellen auf molekularer FLIM von fluoreszierenden Rotoren basierte Landkarten entwickelt.
FLIM bietet einige entscheidende Vorteile gegenüber Intensität-basierte Fluoreszenz-Imaging. Es kann auf photophysikalische Ereignisse, die schwierig oder unmöglich zu Fluoreszenzintensität Bildgebung beobachten sind zu berichten, da es sie von Fluorophorkonzentration Effekte zu trennen kann. Dies ist besonders nützlich für die Zuordnung intrazellulären Viskosität durch Abbilden fluoreszierenden molekularen Rotoren. Die Fluoreszenz-Lebensdauer kann leicht zu einer Viskosität unter Verwendung einer Eichkurve umgewandelt werden, wie in gezeigt. 3, unabhängig von der Konzentration der fluoreszierenden molekularen Rotoren.
In FLIM kann es zu Artefakten, die die Interpretation der Daten erschweren kann. Instrumental 10 Ausstellungsstücken zählen Streulicht, die Show wird als Peak auf der Oberseite des Anfang des Fluoreszenzabklingzeiten und kann mit einer kurzen Abklingzeit verwechselt werden, oder eine kleine Spitze, nachdem der IRF welche sich durch Reflexionen im Innern des Mikroskops verursacht werden. Diese Streulicht Artefakte können als solche identifiziert werdenweil sie mit spektralen Diskriminierung unterschieden werden können – sie sind immer auf der gleichen Wellenlänge wie das anregende Licht. Daran erinnernd, dass in Luft, Licht 30 cm bewegt sich in 1 Nanosekunde hilft, den Ursprung von Reflexionen zu lokalisieren.
Filter-oder Glas-Fluoreszenz könnten auch dazu führen, ein Artefakt, insbesondere bei niedrigen Probenfluoreszenz, aber dies kann leicht durch eine Messung ohne Probe identifiziert werden: wenn ein Zerfall unter diesen Umständen gewonnen wird, ist es aufgrund des Instruments und hat nichts zu tun mit der Probe! Auf der anderen Seite, dass Probe Autofluoreszenz kann auch mit einem Fluoreszenzabklingzeit wirken.
In zeitkorrelierten Einzelphotonenzählung (TCSPC), Time-to-Amplituden-Wandler (TAC) Nichtlinearitäten können zu einer schlechten passt, kann aber durch die Blockierung der Anregung und glänzenden Umgebungslicht, zB aus dem übertragenen Lichtquelle auf die Probe identifiziert werden und Messen der Timing. Eine konstante Hintergrund sollteerhalten in jedem Pixel des Bildes. Regionen, in denen Abweichungen von einer konstanten Hintergrund ablaufen, wird niemals zu ergeben eine gute Passform und sollte für die Messung vermieden werden, wenn sie nicht durch Einstellen der Parameter für die TCSPC Karte eliminiert werden.
Ein berühmt-berüchtigten Artefakt in TCSPC Photon ist Pile-Up, das durch zu hohe Erkennungsrate eines Photons verursacht. 11,12 Dies führt zu einer nur des ersten Photons wird zeitlich und ignoriert alle nachfolgenden Photonen, weil die Elektronik beschäftigt sind Timing und der Verarbeitung des ersten Photons. Pile-up führt zu einer Verkürzung der Fluoreszenz-Lebensdauer, und der beste Weg, um dies zu vermeiden ist es, die Photonen-Zählrate bei rund 1% des Laser-Repetitionsrate zu halten.
Ausblick
Es gibt verschiedene Implementierungen von FLIM und, je nach Anwendung, jeder hat seine Vorteile und Nachteile. 13 Die ideale Fluoreszenzmikroskop erwerben würde die gesamte multidimensionale Fluoreszenz emission Kontur der Intensität, Position, Lebensdauer, Wellenlänge und Polarisation in einer einzigen Messung, mit Single-Photon-Empfindlichkeit, räumliche Auflösung maximale und minimale Messzeit. Es gibt gegenwärtig keine Technologie, mit dieser einzigartigen Kombination von Merkmalen, einen zu bauen und bleibt eine Herausforderung für die Messtechnik-Entwickler. Die Anwendung des neuen physikalischen Techniken, um wichtige Probleme in der Zellbiologie ist oft der Weg zu unerwarteten Entdeckungen, und es gibt einen langen Weg vor uns, bevor wir nah an sättigenden die Fähigkeiten von Fluoreszenz-Imaging für Zellbiologie sind. In der Tat sind Abbildung von Fluoreszenz-Parameter wie Lebensdauer, Spektrum und Polarisation, sowie bildgebende schneller in 3D bei hoher räumlicher Auflösung, bestimmte neue Aspekte in der Zellbiologie zu offenbaren.
The authors have nothing to disclose.
MKK dankt dem britischen Engineering and Physical Science Research Council (EPSRC) Life Sciences Interface-Programm für eine persönliche Gemeinschaft. Wir möchten auch die Finanzierung von der britischen Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) anerkennen.
Sample with fluorescent molecular rotors
Hardware:
inverted Leica TCS SP2 confocal scanning microscope
Coherent Mira 900 Ti:Sapphire femtosecond laser with a Verdi V6 pump laser or Hamamatsu PLP-10 470 picosecond pulsed diode laser excitation sources
Becker & Hickl SPC 830 board in 3GHz, pentium IV, 1GB RAM computer with Windows XP
cooled Becker & Hickl PMC100-01 detector head based on Hamamatsu H5773P-01 photomultipliers, mounted on microscope’s X1 port, or hybrid detectors
DCC 100 detector control module
Software:
TRI-214 or SPCImage 2.8 by Becker & Hickl