Qui vi proponiamo semplici metodi per indurre ipossia in colture cellulari e semplici test per valutare lo stato di ipossia delle culture.
L'ipossia viene definita come la riduzione o la mancanza di ossigeno a organi, tessuti o cellule. Questa diminuzione di tensione di ossigeno può essere dovuta ad un apporto ridotto di ossigeno (cause includono insufficiente rete di vasi sanguigni, difettoso dei vasi sanguigni, e anemia) o ad un aumento del consumo di ossigeno rispetto alla fornitura (causata da un tasso di improvvisa proliferazione di cellule superiore) . L'ipossia può essere fisiologico o patologico, come nei tumori solidi 1-3, artrite reumatoide, aterosclerosi, ecc … Ogni tessuti e cellule hanno una diversa capacità di adattarsi a questa nuova condizione. Durante l'ipossia, l'ipossia inducible factor alpha (HIF) è stabilizzata e regolamenta vari geni come quelli coinvolti nell'angiogenesi o il trasporto di ossigeno 4. La stabilizzazione di questa proteina è una caratteristica di ipossia, quindi il rilevamento HIF è utilizzato di routine per lo screening per 5-7 ipossia.
In questo articolo proponiamo due semplici metodi per indurre ipossia in colture cellulari di mammifero e semplici test per valutare lo stato di queste cellule ipossiche.
Proliferazione cellulare e vitalità in condizioni di ipossia variano molto a seconda dei tipi di cellule. Pertanto, si dovrebbe regolare il numero di cellulare o il numero di piatti culture si parte con per assicurarsi che si avrà abbastanza cellule / proteine per i vostri esperimenti.
Il metodo di cloruro di cobalto ha il vantaggio di essere poco costoso e veloce. Questo prodotto imita ipossia inducendo HIF-1/3α ma può anche regolare altri geni, assicurarsi che questo prodotto sia adatto al vostro progetto, controllando quali altri effetti potrebbe avere sulla funzione e il fenotipo delle cellule particolari indipendentemente dal "mimare- ipossia "effetto. Un altro farmaco usato anche per simulare l'ipossia è deferoxamina mesilato (deferoxamina, impiegato a 100 concentrazione mM finale). L'uso di questi farmaci consente al sperimentatore di aprire la piastra di coltura / piatto / fiasco molte volte senza compromettere la "condizione di ipossia".
Il livello di ossigeno contenuto nella miscela di gas può variare a seconda della esperimenti e tipi di cellule come valori ipossia variano a seconda dei tessuti e tipi cellulari. Infatti, alcune cellule ipossiche sono nel 5% O 2 bisogno di altri meno dell'1% O 2 da ipossia. 5% di CO 2 è aggiunto alla miscela di gas per stabilizzare il pH delle culture, il resto del gas è di solito azoto.
Camere ipossiche hanno il vantaggio di non utilizzare farmaci che possono alternare il comportamento delle cellule indipendentemente dalla tensione di ossigeno. Tuttavia, non tutti i tipi di sperimentazione può essere fatto come l'ossigeno rientra nella camera ad ogni apertura e diminuisce così l'ipossia. Si dovrebbe prendere in considerazione questo fattore nel vostro esperimenti; ipossia / riossigenazione è una specifica condizione che può colpire alcuni tipi di cellule. Un'alternativa è quella di utilizzare postazioni ipossia (collegato al premiscelati serbatoi di gas o per sistemi di miscelazione dei gas) o più grande incubatore ipossia (camera di processo ipossia con vano portaoggetti) che permette la sperimentazione di cambiare i media e manipolare le cellule in continuo ambiente ipossico. Varie camere di ipossia sono stati commercializzati negli ultimi dieci anni e deve essere scelto in base al tuo laboratorio utilizzati, progetti, spazio, dimensione e budget. Sempre garantire il buon uso e la condizione della vostra camera per garantire condizioni di coltura corretto. In generale quando si utilizza una camera, il livello di ipossia può essere modulata scegliendo il mix di gas vari (es. 1%, 5% al 10% di ossigeno).
Per quanto riguarda la rilevazione di HIF-1α, è importante sapere che alcune linee cellulari tumorali esprimere HIF-1α in normossia. E 'quindi fondamentale utilizzare un normossia-controllo per determinare il livello basale di HIF in queste linee cellulari. HIF-1α può anche essere presente in normossia non-maligne delle cellule in seguito alla stimolazione delle cellule o stress. Questo potrebbe verificarsi anche se queste cellule sono affamate, assicurarsi che il proprio colture di cellule di alimentazione siano correttamente e mantenuto.
The authors have nothing to disclose.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
---|---|---|
Anti-HIF-1α | Invitrogen | 458400 |
Cobalt (II) Chloride | Sigma | C8661-25G |
Incubator Chamber | Billups-rothenberg | MIC-101 |
HRE-Luciferase plasmid | Adgene | Plasmid 26731 |