Малоинвазивных протокол для стабилизации позвоночника мыши и выполнять повторяющиеся<em> В естественных условиях</em> Спинного изображений шнур с помощью двух-фотонной микроскопии описаны. Этот метод сочетает в себе спинного устройств стабилизации и обезболивающий режим для минимизации дыхательных вызванных движениями и производить необработанные данные изображения, которые не требуют выравнивания или других пост-обработки.
В естественных изображений с помощью двух-фотонной микроскопии 1 у мышей, которые были генетически выразить флуоресцентных белков в определенных типах клеток 2-3 значительно расширили наши знания о физиологических и патологических процессов в различных тканях в естественных условиях 4-7. В исследованиях центральной нервной системы (ЦНС), наблюдается широкое применение в естественных изображений в мозге, который выпустил множество новых и часто неожиданные выводы о поведении клеток, таких как нейроны, астроциты, микроглия, под физиологических или патологических состояний 8-17. Тем не менее, в основном технические сложности имеют ограниченные реализации в области обработки изображений естественных условиях в исследованиях живой мыши спинного мозга. В частности, анатомическая близость спинного мозга в легкие и сердце генерирует значительные артефакты движения, что делает изображение живым спинного мозга сложной задачей. </р>
Мы разработали новый метод, который позволяет преодолеть ограничения, присущие спинного изображений шнура путем стабилизации позвоночника, уменьшения дыхательных вызванных движениями и тем самым облегчая использование двух-фотонной микроскопии для изображения мыши спинного мозга в естественных условиях. Это достигается путем объединения индивидуальных спинного устройство стабилизации с методом глубокого наркоза, что привело к значительному сокращению дыхательных вызванных движениями. Это видео протоколе показано, как предоставить небольшой участок живой спинного мозга, которые могут быть сохранены в стабильных физиологических условиях в течение длительного периода времени, сохраняя повреждения тканей и кровотечение к минимуму. Представитель сырых изображений, полученных в естественных деталей в высоком разрешении тесную связь между микроглии и сосудов. Timelapse последовательность показывает динамическое поведение микроглии процессов в живой мыши спинного мозга. Кроме того, непрерывное сканирование одного и того же г-кадр продемонстрироватьс выдающейся стабильности, что этот метод может достичь для получения стеков изображений и / или timelapse фильмы, которые не требуют выравнивания изображения после приобретения. Наконец, мы покажем, как этот метод может быть использован для пересмотра и Reimage же участок спинного мозга на более поздних timepoints, что позволяет для продольного исследования текущих физиологических или патологических процессов в живом организме.
Метод, описанный здесь сохраняется стабильная и повторяющихся в естественных изображений густонаселенных флуоресцентные клеточных структур в спинной мозг мышей под наркозом с помощью двух-фотонной микроскопии. Достигнутая стабильность является результатом заказ спинного уст?…
The authors have nothing to disclose.
Работа выполнена при поддержке Национального общества рассеянного склероза грант RG4595A1 / T с РД и NIH / NINDS гранты NS051470, NS052189 и NS066361 К. А. Рисунки и фильмы адаптированы и / или перепечатана из Давалос и соавт., J Neurosci методы. 30 марта 2008; 169 (1) :1-7 Copyright 2008, с разрешения Elsevier.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Yorumlar |
Rhodamine B dextran | Invitrogen | D1841 | 70 kDa, diluted in ACSF (3% w/v) |
Ketamine HCl | Bionichepharma | NDC No: 67457-001-10 | Injectable, 50mg/ml |
Anased | Lloyd Labs | NADA No: 139-236 | Xylazine injectable, 20mg/ml |
Acepromazine | Vedco | NADA No: 117-531 | Injectable,10mg/ml |
Artificial tears ointment |
Phoenix pharmaceutical |
NDC No: 57319-760- 25 |
Lubricant |
Betadine | Fisher | 19-061617 | |
McPherson-Westcott Scissors |
World Precision Instruments |
555500S | Curved, blunt-tip scissors |
Straight Forceps | World Precision Instruments |
555047FT | Toothed tip forceps |
Small vessel cauterize | Fine Science Tools | 18000-00 | |
Gelfoam | Pharmacia,Pfizer Inc. | Mixer Mill MM400 | |
Compact spinal cord clamps |
Narishige | STS-A | |
Head holding adaptor | Narishige | MA-6N | |
Gelseal | Amersham Biosciences Corp. |
80-6421-43 | |
Lactated Ringers | Baxter Healthcare | 2B8609 | |
Buprenex | Reckit Benckiser Pharmaceuticals Inc. |
NDC No: 12496- 6757-1 |
Buprenorphine, injectable |
Baytril | Bayer | NADA 140-913 | Enrofloxacin, antibacterial injectable 2.27% (20ml) |
Heating pad – Large | Fine Science Tools | 21060-10 |