マウスの肝臓虚血のためにハンギング軽量システムの利用

一般的な発言。すべての操作は、直立解剖顕微鏡（ライカ）の下や手術凝固装置を用いて実行する必要があります。実験とシャム群のマウスは、結果の比較可能性を確保するために年齢と体重で一致する必要があります。体温、血圧、麻酔と流体管理は、安定した全体の実験中に監視する必要があります。 1。麻酔と手術 C57BL / 6マウスは、10から16週齢の範囲内でなければなりません、彼らは性別をマッチさせたそれぞれのグループでなければなりません。 ペントバルビタールナトリウム（70 mg / kg体重のIP）にマウスを麻酔し、約麻酔を維持しています。は10 mg / kg / hのペントバルビタールナトリウム。過量投与は有意に血圧を下げることができるので、結果を変更することができます。 サーマル·フィードバックに接続された直腸の温度計のプローブを用いた温度制御加熱されたテーブル（RT、Effenberg、ミュンヘン、ドイツ）の上に置いてマウス37℃で体温を維持するためにコントローラ℃、 取り外し可能なテープでテーブルに取り付けられた上下肢で、手術のテーブルの上に仰臥位にマウスを置きます。 生存実験髪のクリッピングを含む適切な無菌テクニックを、ヨードフォア（例えばBetadine）で皮膚の消毒、オートクレーブ滅菌した器具の取扱いの場合に、外科医のための滅菌手袋が必要とされるマスクを使用します。 2。ポータルトライアド咬合皮膚をカットするため、マウスの毛アレルギーのリスクを防止することにより、マウスの毛の吸入を防ぐためにミネラルオイルを切開領域をカバーしています。あなたが容易に肝臓を公開できるように、最大​​の上端に白線の正中開腹切開を行います。可能であれば、出血を防ぐために、凝固電極（エルベ、ICC50、チュービンゲン、ドイツ）で切開を行います。 尾が方向であることの位置にマウスを使って加熱テーブルを配置外科医にテッド。その位置は、トライアドをローカライズし、縫合糸を配置するために最適な設定を提供します。 ポータルトライアドを公開するために湿った綿棒の綿棒を使用して、右側の腸を置換する。 少しダイアフラムに向かって中央と左葉と腸に向かって右葉をシフトします。それはあなたの右、左/中央ローブの分岐上にポータルトライアドのクリアな視界が得られます。 慎重にポータルトライアドを検査し、当たり障りのないピンセットでそっと右葉を保持します。それはあなたの左のポータルトライアドの素敵なビューを提供します。 左から右側に肝動脈、肝静脈、胆管を含む左側のポータルトライアドの下でニードルホルダーを介して、縫合糸（エチコン、ノルダーシュテット、ドイツ7/0ナイロン縫合糸）を一度視覚的に特定された場所に針をマウスの。 ステッチは、トライアドの下に密接にする必要があります。深いステッチの下に配置され静脈VACA劣っを傷つけることができるトライアド。したがって、ステッチを配置する前に下大静脈を識別するために、ピンセットで肝右葉を押したままにします。 鉗子で右側の針の先端を取り、肝臓を傷つけることなく肝臓領域外にそっと引き出します。 縫合エッペンドルフチュー​​ブ（水で満たされた約3グラム）の各端部に接続し、両方の縫合糸は、縫合糸ホルダーを介して終了に配置します。縫合糸は、右のトライアドに干渉しないようにステッチの遠位縫合糸ホルダーを配置します。 ウェイトを適用することにより、トライアドは、肝臓の左と中央葉への血液供給の中断を引き起こし、即座に閉塞されます。成功した閉塞は容易に虚血葉の淡い白化の目視検査によって確認することができる。ぶら下がって重みが極から放出されると肝臓が灌流されたときとは対照的に、色の変更はすぐに消えます。この部分肝虚血モデルではblooを維持することで腸間膜混雑を回避する肝右葉にdフロー。 腹腔内に腸を交換してください。 37.0で水に浸した濡れた綿棒℃で、肝臓と腸を暖かく保つさらに、手術を終えた後、市販の食品用ラップでマウスを覆う体温が安定して維持する。 実験プロトコルごとに、必要に応じて虚血を実行します。定義されている虚血時間のリリース後に中央値と肝左葉の重量と再灌流は直ちに開始されます。この手法は、マウスで可逆的虚血を作り出すことができます。それ以上の虚血時間が実行されません場合、慎重に縫合糸を除去します。 15分前に直接再灌流後の腹腔内に約400μlの塩化ナトリウムを追加します。再灌流時に流体の損失を補償する100μlの量は30分ごとに流体を代用し続けています。 生存実験のために手術創は連続筋肉壁の縫合、皮膚wiを使って閉じている4/0縫合番目。 3。肝灌流の変化以下の結果のパラメータは肝虚血後に肝障害を決定するために推奨されています。 肝酵素（例えば、ALT、AST）および肝臓組織学（H＆E染色）は、以下の肝虚血再灌流3,9を決定します 。 図1肝虚血にかける重みシステムのモデル：吊り下げ重量システムは、左と中央葉3の肝虚血を誘発するために設立されました。 （）したがって、尾状核と右葉はそっと左葉から分離した。右葉は明らかに右、中央と左葉の分岐上にポータルトライアドを表示するには、その後わずかにシフトした。 8.0ナイロン縫合糸は、左肝トライアド下に置かれた。 （B）それぞれの縫合糸の端にある小さな重量（3グラムエッペンドルフTU水で満たされたBES）が付属して適用した。肝虚血は、赤から淡い左と中央葉の色の変化によって表示されます。この実験的なデザインは、重量負荷を適用し、解放することによって肝左トライアドの正確な閉塞および再潅流することができます。 図2アラニン（ALT）とアスパラギン酸（AST）マウスにおけるアミノトランスフェラーゼの異なる肝虚血時間の影響。部分的なポータルトライアドの虚血は、示された（ – 60分虚血0）として誘導した。再灌流2時間後、ALT（A）とA​​ST（B）を測定した。 7匹/群 – 結果は平均±SE 6のように表される。 0分虚血（偽コントロール）と比較* P <0.05。