Özet

Utilizzando luciferasi di infezioni batteriche immagine in topi

Published: February 18, 2011
doi:

Özet

Metodi per l'imaging bioluminescenza delle infezioni batteriche in animali viventi sono descritti. Gli agenti patogeni sono stati modificati per esprimere la luciferasi che permette l'imaging ottico intero corpo di infezioni negli animali vivi. I modelli animali possono essere infettati da agenti patogeni che esprimono luciferasi e il decorso della malattia conseguente visualizzati in tempo reale da parte di imaging bioluminescenza.

Abstract

Imaging è una tecnica preziosa che può essere utilizzata per monitorare i processi biologici. In particolare, la presenza di cellule tumorali, cellule staminali, specifici tipi di cellule immunitarie, agenti patogeni virali, parassiti e batteri possono essere seguiti in tempo reale all'interno di animali viventi 1-2. Applicazione di imaging bioluminescenza per lo studio di agenti patogeni presenta vantaggi rispetto alle strategie tradizionali per l'analisi delle infezioni in modelli animali 3-4. Le infezioni possono essere visualizzati all'interno di un singolo animale, nel tempo, senza richiedere l'eutanasia per determinare la posizione e la quantità del patogeno. L'imaging ottico permette la visione completa di tutti i tessuti e organi, piuttosto che il campionamento dei siti precedentemente nota l'infezione. Inoltre, l'accuratezza della inoculazione in tessuti specifici possono essere direttamente determinato prima di portare gli animali in avanti che sono stati inoculati senza successo in tutto l'intero esperimento. Variabilità tra gli animali possono essere controllati per, dal momento che l'imaging permette ad ogni animale da seguire individualmente. Imaging ha il potenziale per ridurre notevolmente il numero degli animali necessari a causa della possibilità di ottenere dati da numerosi punti di tempo, senza dover tessuti campione per determinare il carico patogeno 3-4.

Questo protocollo descrive i metodi per visualizzare le infezioni negli animali vivi utilizzando l'imaging bioluminescenza di ceppi di batteri ricombinanti che esprimono luciferasi. Lo scarabeo clic (CBRLuc) e luciferases lucciola (FFluc) utilizzano come substrato luciferina 5-6. La luce prodotta da entrambe le CBRluc e FFluc ha una lunghezza d'onda largo da 500 nm a 700 nm, rendendo questi giornalisti luciferases eccellente per l'imaging ottico in modelli animali che vivono 7-9. Ciò è dovuto soprattutto lunghezze d'onda della luce superiore a 600 nm sono necessari per evitare l'assorbimento da parte dell'emoglobina e, quindi, i viaggi attraverso il tessuto dei mammiferi in modo efficiente. Luciferasi è geneticamente introdotto i batteri per produrre segnale luminoso 10. I topi sono polmonare inoculati con batteri bioluminescenti intratracheally per consentire il monitoraggio delle infezioni in tempo reale. Dopo l'iniezione luciferina, le immagini sono acquisite con il Imaging System IVIS. Durante l'imaging, i topi vengono anestetizzati con isoflurano utilizzando un XGI-8 Sistema Gas Anethesia. Le immagini possono essere analizzati per localizzare e quantificare la sorgente del segnale, che rappresenta il sito di infezione batterica (s) e il numero, rispettivamente. Dopo l'imaging, la determinazione CFU viene effettuata sul tessuto omogeneizzato per confermare la presenza di batteri. Diverse dosi di batteri vengono utilizzati per correlare numeri batterica con luminescenza. L'imaging può essere applicato allo studio della patogenesi e la valutazione dell'efficacia di composti antibatterici e vaccini.

Protocol

1. Infezione polmonare da intubazione intratracheale Pesare topi e, opzionalmente, i marchi possono essere fatti sulle orecchie per una facile identificazione. Anestetizzare i topi con ketamina (100 mg per g di peso del mouse) e xilazina (10 mg per g di peso del mouse) per inoculazione intraperitoneale. Topi posto nelle gabbie fino completamente anestetizzato. Spremere le pastiglie dei loro piedi per controllare pedale riflesso. I topi dovrebbe visualizzare ridotta o nessuna reazione rifle…

Discussion

Anche se dopo questi protocolli di solito provoca immagini di alta qualità, è importante prendere in considerazione alcuni punti chiave per ottenere dati precisi e coerenti da studi di imaging. Luminescenza immagini dovrebbero essere acquisite che hanno conti da 600 a 60.000 per assicurare che il segnale è al di sopra di fondo e la fotocamera non è saturo. Se il segnale ottenuto è minore di 600 le condizioni di esposizione deve essere regolata per incrementare la conta. Se il segnale ottenuto è di oltre 60.000 la …

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori ringraziano i membri Cirillo laboratorio per le discussioni di valore e di assistenza in tutto questo studio. Ringraziamo il Dr. Joshua Hill e il laboratorio del Dr. James Samuel per assistenza durante le riprese di questo protocollo. Questo lavoro è stato finanziato dalla borsa 48523 dalla Bill & Melinda Gates Foundation e concedere AI47866 dal National Institutes of Health.

Materials

Material Name Tip Company Catalogue Number Comment
Isoflurane   VETONE 501027  
Ketamine   Butler animal health supply    
Xylazine   MP Biomedical 158307  
Luciferin   GMT LUCK-100  
Fetal plus solution   VOR tech pharmaceutical    
Cathether (22G x 1”)   TERUMO OX2225CA  
Guide wire   Hallowell EMC 210A3491  
Octocope with speculum   Hallowell EMC 000A3748  
Xenogen IVIS system   Caliper Life Sciences    
XGI-8-gas Anesthsia System   Caliper Life Sciences    
Living Imaging Software   Caliper Life Sciences    
Transparent nose cones   Caliper Life Sciences    
Light baffle divider   Caliper Life Sciences    

Referanslar

  1. Wilson, T., Hastings, J. W. Bioluminescence. Annu Rev Cell Dev Biol. 14, 197-230 (1998).
  2. Contag, C. H., Bachmann, M. H. Advances in in vivo bioluminescence imaging of gene expression. Annu Rev Biomed Eng. 4, 235-260 (2002).
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Bu Makaleden Alıntı Yapın
Chang, M. H., Cirillo, S. L., Cirillo, J. D. Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice. J. Vis. Exp. (48), e2547, doi:10.3791/2547 (2011).

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