ペプチジル- tRNAの初期段階を含むリボソームの生化学的解析への大きな障害は、同じサンプル中の他のリボソーム、解析対象の特定のmRNA配列の翻訳に関与していないリボソームの存在となっています。我々は、排他的に、興味の発生期のペプチジル- tRNAを含むリボソームを精製するための単純な方法論を開発。
最近、構造的および生化学的研究は、抗生物質によるタンパク質合成の阻害の間と新生ポリペプチド合成中のリボソームに発生する分子事象の多くを紹介しています。これらの抗生物質、および主にペプチジル- tRNAの形で規制の新生ポリペプチドの一部は、ペプチド結合の形成や翻訳終止1から7のいずれかを阻害する。これらの抑制イベントは、リボソームの動き、"トランスレーショナル逮捕"と呼ばれる現象を停止することができます。抗生物質または新生ポリペプチドのいずれかにより誘導される翻訳の停止は、細胞増殖、抗生物質耐性、タンパク質転移と細胞の代謝8月13日などの多様な細胞機能に関与する遺伝子の発現を調節することが示されている。我々はあらゆる生物において、翻訳におけるリボソームの役割を完全に理解したならば、抗生物質と規制の新生ポリペプチドは、リボソームの機能を変更する方法の知識が不可欠です。
ここで、我々は、排他的に、浄化分析のために、それらのリボソームは特定のmRNAを翻訳し、特定のペプチジル- tRNAの14を含むために使用できるシンプルな方法論を説明します。この手順は、ビオチン標識されたmRNAに結合したリボソームの翻訳の選択的分離に基づいています。これらのトランスレーショナル複合体はストレプトアビジン磁性ビーズ(SMB)と磁場(MF)を使用して、同じ混合物中の他のリボソームから分離されています。ビオチン標識mRNAがT7転写プロモーターを含むテンプレートPCR -生成されたDNA断片として使用してランオフ転写アッセイによって合成される。 T7 RNAポリメラーゼは、ビオチン- UTPからビオチン- 16 – UMPを搭載し、我々の条件下で約10ビオチン- 16 – UMPの分子は25%UMPの含有量600 NTのmRNAに組み込まれています。これらのビオチン標識mRNAがその後分離し、放出因子2(RF2)で実行vitro翻訳アッセイにおいて使用されている枯渇野生型または変異型リボソームを含む大腸菌の菌株から得られた無細胞抽出液を。ビオチン標識されたmRNA配列を翻訳するリボソームが原因で、通常、翻訳終結を達成RF2タンパク質の不在に、終止コドンの領域で停滞している。新たに合成されたペプチジル- tRNAを含むストールしたリボソームを単離し、SMBとMFを使用して翻訳反応から削除されます。これらのビーズは、ビオチン含有メッセージをバインドします。
隔離された、翻訳複合体は、野生型または変異型リボソームのコンポーネント、またはペプチジル- tRNAのシーケンスだけでなく、抗生物質または他の分子の要因1,14-16とリボソームの相互作用を決定するための構造的および機能的特徴を分析するために使用することができます。これらの単離されたリボソーム複合体の機能を調べるために、ペプチジル-トランスフェラーゼアッセイは、抗生物質ピューロマイシン1の存在下で行うことができます。翻訳複合体の構造変化を調べるために、十分に確立された手順は、特定のアミノ酸14および/ またはii)アルキル化保護アッセイ1,14,17に)そのような私として、架橋を使用することができます。
このレポートに記載されて、この分離手順では、高い再現性です。残念なことに、同じ翻訳配列から生成された短いペプチジル- tRNAの存在が便利に回避することはできません。このようなペプチジル- tRNAのは合計絶縁材料(図2C)の15-20%に対応することがあります。ビオチン標識されたmRNAの高い濃度が使用されているまたは使用される無細胞抽出液が古い場合や、何度も再使用されているときに、これらの汚染物質は、濃度に増加する場合があります。したがって、in vitro翻訳反応でのコンポーネントの品質と濃度を制御するために非常に重要です。また、商業的な高効率無細胞抽出液を再構成した同じ目的(PUREシステム)18のために使用できる利用可能です。
この方法を使用して、ビオチン- 16 – UMPは、ランダムにターゲットmRNAの長さに沿って組み込まれています。ウリジンのトラクトを含むいくつかのORFは、その翻訳に影響を与えず、それらの配列にこの修飾ヌクレオチドを組み込んだている可能性があります。 biotin-16-UTP/UTPの変数の相対濃度は、最も効率的な翻訳を得るために、mRNAの合成中にテストする必要があります。ビオチン標識の代替法は、mRNAの5'末端、最も安定したエンドをターゲットに、使用することができます。 (ⅰ)ビオチンは、3' – NH2ATP(3' -アミノ基、3' -デオキシアデノシン三リン酸)とT4 RNAリガーゼ19を用いて mRNAの5' -末端に結合することができます。 (ⅱ)5'末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドは、T4 RNAリガーゼとしても20を用いてmRNAの5' -末端に結合することができます。 (iii)のmRNAの5'末端に相補的な配列に対応する3'末端ビオチン標識オリゴデオキシヌクレオチドはまた、翻訳複合体を分離するために使用することができる。これらのビオチン標識オリゴデオキシヌクレオチドを分離する前に、SMBに接続することができます。後でSMBは、に接続されているビオチン標識オリゴデオキシヌクレオチドは、それらの相補的mRNA配列との相互作用を可能にするために、翻訳反応混合物と混合することができます。単離後、ハイブリッドRNA – DNA領域 – とビオチン標識オリゴヌクレオチドおよびmRNA配列との間でハイブリダイズする領域は、 – ストレプトアビジンビーズから停止複合体を分離し、RNアーゼHを用いて劣化した可能性があります。この代替方法では、複合体は、高解像度の方法を使用して、将来の構造解析に用いることができる可能性があります。
The authors have nothing to disclose.
LRC – V。博士Adriel D.ジョンソン、その最優先事項は、常に学生の教育であった素晴らしい教授のメモリにこの論文を捧げたいと考えている。我々は、Adrielをあなたがいなくて寂しい。我々は本研究で説明されている実験を行うことで彼女の助けのためのジャクリーンモレノに感謝しています。この研究は国立科学財団、MCB – 0615390から、とLRC – Vに提供スタートアップ資金でCYに提供する助成金によって支えられている。ハンツビルのアラバマ大学から。
Material Name | Tip | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Tris base | Sigma | 252859 | ||
Magnesium acetate | Fluka | 63049 | ||
Potassium glutamate | Sigma | G1501 | ||
Ammonium acetate | Fluka | 09688 | ||
PMSF | Sigma | P7626 | ||
Protein A sepharose 4B slurry beads | Sigma | P9424 | ||
Leupeptin inhibitor | Sigma | L9783 | ||
Taq-DNA polymerase | Stratagene | 201223 | ||
T7 Maxiprep kit | Promega | P1300 | ||
SMB | Promega | Z5482 | ||
Biotin-16-UTP | Roche | 1388908 | ||
ATP | Sigma | A7699 | ||
GTP | Sigma | G8877 | ||
PEP | Sigma | P7002 | ||
PK | Sigma | P7768 | ||
Polyethylenglycol 8000 | Fluka | 81268 | ||
Folinic acid | Fluka | 47612 | ||
Spermidine | Fluka | 85558 | ||
tRNA from E. coli | Sigma | R1753 | ||
DEPC | Sigma | D5758 | ||
Tricine | Sigma | T5816 | ||
L-amino acids | Sigma | LAA21 | ||
DTT | Fluka | 43815 | ||
magnetic separation stands | Promega | Z5342 |