Il sistema di fibra Gigante è un semplice circuito neuronale di adulti<em> Drosophila melanogaster</em> Contenente la più grande neuroni al volo. Noi descriviamo il protocollo per il monitoraggio trasmissione sinaptica attraverso questo percorso attraverso la registrazione dei potenziali sinaptici posta in dorsale longitudinale (DLM) e tergotrochanteral (TTM) muscoli dopo stimolazione diretta del interneuroni fibra gigante.
Quando spaventato adulto D. melanogaster reagire saltando in aria e volare via. In molte specie di invertebrati, tra cui D. melanogaster, la "fuga" (o "spaventare") risposta durante la fase adulta è mediato dal multi-componente del circuito neuronale chiamato Sistema fibra Gigante (GFS). La dimensione comparativa di grandi dimensioni dei neuroni, la loro particolare morfologia e connettività semplice rendere il modello GFS un sistema interessante per lo studio di circuiti neuronali. Il percorso GFS è composto da due simmetria bilaterale gigante Fibra (GF) interneuroni cui assoni scendono dal cervello lungo la linea mediana nel ganglio toracico tramite il connettivo cervicale. Nel neuromere mesothoracic (T2) dei gangli ventrali forma GF elettro-chimica delle sinapsi con 1) il dendrite grande mediale della motorneuron ipsilaterale (TTMn) che aziona il muscolo tergotrochanteral (TTM), l'estensore principale per il femore mesothoracic / gamba , e 2) controlaterale interneurone perifericamente sinapsi (PSI), che a loro volta forme chimiche (colinergici) sinapsi con i motoneuroni (DLMns) dei muscoli dorsali longitudinali (DLMS), l'ala depressori. Il percorso neuronale (s) ai muscoli dorsovental (DVMS), gli ascensori ala, non è stato ancora elaborato (il DLMS e DVMS sono noti congiuntamente come i muscoli di volo indiretto – che non sono collegati direttamente alle ali, ma piuttosto spostare l' ali indirettamente distorcendo la cuticola vicina toracica) (King e Wyman, 1980;. Allen et al, 2006). Il di-sinaptica attivazione del DLMS (via PSI) causa un ritardo piccolo ma importante nel momento della contrazione di questi muscoli relativi alla attivazione monosinaptico di TTM (~ 0,5 ms), permettendo di estendere TTMs prima del femore e spingere il volare da terra. Il TTMs contemporaneamente stiro-attivare il DLMS che a sua volta tratto reciprocamente-attivare il DVMS per tutta la durata del volo. Il percorso GF può essere attivato sia indirettamente applicando una sensoriale (ad esempio "air-puff" o "luci-off") stimolo, o direttamente da un sovra-soglia di stimolo elettrico al cervello (descritto qui). In entrambi i casi, un potenziale d'azione raggiunge il TTMs e DLMS solo attraverso il GF, SIPS, e TTM / DLM motoneuroni, anche se la TTMns e DLMns hanno altre, non ancora identificato, input sensoriali. Misura "risposta latenza" (il tempo che intercorre tra la stimolazione e la depolarizzazione del muscolo) e il "seguito alla stimolazione ad alta frequenza" (il numero di risposte efficaci a un certo numero di stimoli ad alta frequenza) fornisce un modo per valutare in modo riproducibile e quantitativamente lo stato funzionale dei componenti GFS, includendo sia le sinapsi centrale (GF-TTMn, GF-PSI, PSI-DLMn) e la chimica (glutamatergica) giunzioni neuromuscolari (TTMn-TTM e DLMn-DLM). È stato usato per identificare i geni coinvolti nella formazione di sinapsi centrali e per valutare la funzione del SNC.
Una delle cose più importanti si deve prestare attenzione quando si cerca di ottenere registrazioni di alta qualità è il giusto orientamento e la salute della preparazione. Idealmente, il volo dovrebbe essere ancora vivo alla fine della sessione di registrazione e reattivo agli stimoli elettrici. Per gli elettrodi di registrazione per penetrare in modo più efficiente l'esoscheletro toracica, il volo deve essere incollata alla superficie in modo da formare un angolo retto con gli elettrodi, se necessario, l'inserimento di elettrodi può essere facilitato dalla rimozione di una porzione del dorsal cuticola thoracic con uno scalpello tungsteno esponendo così le muscle DLM volo (questo passo offre un ulteriore vantaggio di rendere più difficile per le punte degli elettrodi di vetro per rottura). Inoltre, la cura deve essere presa per evitare di spingere gli elettrodi attraverso i DLMS subcuticularly trova e TTMs. La testa della mosca deve essere ben assicurato per consentire la elettrodi stimolanti per essere adeguatamente inserito nel cervello e di impedire loro di essere tirato fuori durante la sessione di registrazione.
Grazie alle sue dimensioni e ben descritta la morfologia, la GFS rappresenta uno dei percorsi più accessibili neuronali in Drosophila. La permeabilità delle sinapsi elettriche ai coloranti piccolo peso molecolare tracciante permette la visualizzazione dei neuroni elettricamente accoppiati, e diverse linee GAL4 disponibili consentono di manipolare i livelli di espressione genica in un sottogruppo di cellule o gruppi di cellule (Jacobs et al, 2000;. Allen et al., 2006) In aggiunta ai vantaggi di cui sopra, sia i componenti afferenti ed toracica di proprietà di visualizzazione del circuito, come abitudine, il recupero spontaneo e dishabituation, rendendo la GFS Drosophila un sistema modello ideale per studiare la plasticità neuronale (Engel e Wu, 1996).
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato supportato da una Wellcome Trust borsa di LP
NAME | COMPANY | CAT. # | COMMENTS |
S48 Square Pulse Stimulator | Grass Instruments | http://www.grasstechnologies.com/ | |
Stimulation unit | Grass Instruments | http://www.grasstechnologies.com/ | |
SIU5 RF Transformer Isolation Unit | Grass Instruments | http://www.grasstechnologies.com/ | |
5A two-channel intracellular Microelectrode Amplifier | Getting Instruments | http://www.gettinginstruments.com/ | |
Digidata 1440A data acquisition system | Molecular Devices | http://www.moleculardevices.com/ | |
Analogue-digital Digidata 1320 and Axoscope 9.0 software | Molecular Devices | http://www.moleculardevices.com/ | |
Recording platform with manual micromanipulators | Narishige, Sutter Ins., World Precision Ins. | http://narishige-group.com/ http://www.sutter.com/index.html http://www.wpi-europe.com/en/ |
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Light source | Fostec | http://www.nuhsbaum.com/FOSTEC.htm | |
Wild M5 stereomicroscope | Wild Heerbrugg | http://www.wild-heerbrugg.com/ | |
Vibration isolation table | TMC | http://www.techmfg.com/ | |
Borosilicate tubing for microelectrodes | Sutter Instrument | http://www.sutter.com/index.html | |
P-95 Micropipette puller | Sutter Instrument | http://www.sutter.com/index.html | |
Microfil 34 gauge, 67 mm (electrode filler) | World Precision Instruments | MF34G-5 | http://www.wpi-europe.com/en/ |
Microdissection tools (forceps,…) | Fine Science Tools | www.finescience.com | |
Dissecting (stereo) microscope | Leica | http://www.leica-microsystems.com/ | |
Faraday cage | Unknown manufacturer |
Other: plastic syringes, tungsten earth wire and NaOH-sharpened tungsten electrodes, KCl, wax platform, a PC with monitor…