遗传协会经常保持在功能级别上的原因不明。这种方法的目的是,通过分析细胞转录单核苷酸多态性杂合子基因表达,以评估的表型相关的遗传标记的影响。该技术可以精确测量,用MALDI – TOF质谱定量等位基因特异性引物延伸产品。
与常见的复杂特征显着的遗传协会的数量不断增加。然而,这些协会的大多数并没有被理解在分子水平上。介导的DNA变异的表型的影响的机制之一是,这已被证明特别是对复杂性状1相关的基因表达。
这种方法测试蜂窝上下文特定的DNA序列,基因表达的影响。其原理是相对丰度测量所产生的一个基因的两个等位基因,分析细胞进行与疾病(风险变种)2,3相关的DNA序列的一个副本成绩单。因此,这种方法使用的细胞应该满足了两个基本基因型要求:他们必须为DNA风险的变种和DNA分子标记,通常的编码基因多态性,基于他们的染色体的起源(图1)可以区分成绩单的杂合子。 DNA风险的变种和DNA标记不需要具有相同的等位基因频率,但阶段(haplotypic)的遗传标记的关系,需要理解。同样重要的是,选择感兴趣的基因的细胞类型,表达。此协议专指通过从成纤维细胞中提取核酸的过程,但该方法是同样适用于其他细胞类型,包括原代细胞。
从选定的细胞株DNA和RNA的提取和cDNA的生成。 DNA和cDNA进行了分析与设计目标编码DNA标记4,一个引物延伸实验。引物延伸实验进行使用MassARRAY(Sequenom公司)5平台,根据制造商的规格。引物延伸产品,然后分析了基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF/MS)时间。由于选定的标记是杂合子,他们将生成两个山峰上的MS情景。每个峰的面积是成正比的转录丰度和可与MassARRAY导电型测量仪软件功能生成一个等位基因的比例(等位基因1:等位基因2)测量计算。等位基因的cDNA获得的比例是使用从基因组DNA,其中等位基因的比例预计为1:1,以正确的技术构件规范化。与归一化的等位基因的比例显着不同的为1的标记表明,两个在同一个细胞的染色体产生的成绩单金额是不同的,这表明DNA与表型相关的变种基因表达的影响。应该用实验控制,以确认结果。
这种方法使体内等位基因特异性转录水平的差异,评估评价疾病相关基因表达的DNA变异的影响。在这个协议中的相对转录丰度的MALDI – TOF,但其他技术允许,如TaqMan探针6,7,等位基因特异的定量测量,都可以使用。这种方法的主要限制是转录编码标记的可用性。这里描述的方法原则的基础上,但利用不同类别的多态性,已描述。 haploChip检测措施,使用1 KB的转录的开始或结束一个基因,这将是在与特定RNA 聚合酶 II 8的抗体染色质免疫沉淀隔离材料的网站内的标记的等位基因特异性表达。此外,内含子单核苷酸多态性模板时,可以使用异RNA 的 9 。
这里描述具体的协议,与haploChip检测相结合,已成功地用于确定为读写障碍的候选基因(或阅读障碍)。最初遗传关联研究,发现与诵读困难和这是跨越3个基因的10相关的DNA序列。等位基因特异的基因表达检测结果显示,在存在的诵读困难相关的DNA变异的表达变化,发现只有三个基因中的一个,但不是其他两个11。
The authors have nothing to disclose.
Material Name | Tip | Company | Catalogue Number | Comment |
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PBS | Sigma | P-4417-100TAB | ||
SDS | Biorad | 161-0416 | ||
NaCl | VWR | 27788.366 | ||
Tris | Sigma | T1503-1KG | ||
EDTA | Sigma | E5134-500G | ||
RNase A | Qiagen | 19101 | ||
Proteinase K | Sigma | P2308-500MG | ||
Phenol: chloroform | Sigma | 77617 | ||
Chloroform | VWR | 100777C | ||
Ethanol | Sigma | 32221-2.5L | ||
Trizol | Invitrogen | 15596-018 | ||
RNeasy kit | Qiagen | 74104 | ||
SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18080-044 | ||
Immolase Taq | Bioline | BIO-21048 | ||
dNTP | Sigma | DNTP100A | ||
Exonuclease 1 | NEB | M0293S | ||
Shrimp Alkaline Phosphatase | GE Healthcare | E70092Z | ||
SpectroCLEAN resin | Sequenom | 10053 | ||
MassEXTEND ddNTP/dNTP mix | Sequenom | Varies according to assay design | ||
MassEXTEND thermosequenase | Sequenom | 10052 | ||
Equipment | ||||
Chilled microcentrifuge | Eppendorf | |||
NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | |||
SpectroPOINT nanolitre dispenser | Sequenom | |||
SpectroREADER mass spectrometer | Sequenom |