我们寻求定义冷预处理手段确定疗法的发展新目标,以保护脑损伤发病前的神经免疫信号。我们目前所做的这些工作需要的生物系统,实验操作,加上技术能力的高度重复性和敏感的战略。
神经损伤的发病率和死亡率的常见原因,从一般的麻醉和相关手术过程中,可以有效的发展缓解,易于管理和安全的预处理治疗。我们寻求定义冷预处理手段确定疗法的发展新目标,以保护脑损伤发病前的神经免疫信号。低级亲炎症介质,信号随时间变化的冷预处理神经保护作用是必不可少的。这个信号是一致的生理调节兴奋效应的基本原理,这就需要刺激性的刺激达到足够的时间适应保护的刺激阈值的大小,才能显现。
因此,在冷预处理神经保护作用的免疫信号划分要求,生物系统和实验操作,再加上技术能力的高度重复性和敏感。我们的做法是使用作为海马脑片培养,在体外模型,密切反映他们在与多突触的神经网络,成熟的和静态的胶质细胞/小胶质细胞的影响体内同行。小胶质细胞胶质状态尤为重要,因为它们的细胞因子的主要来源,这是femtomolar范围执行。此外,切片文化,可以在体外保持几个星期,这是足够的时间来唤起激活刺激和评估的适应性反应。最后,环境条件,可以准确地控制使用切片文化,使细胞因子信号寒冷的预处理可以进行测量,模仿,并调制,剖析关键的节点方面。细胞因子信号系统的分析需要使用的敏感和可重复性复用的技术。我们使用肿瘤坏死因子-α定量PCR,实时定量PCR定量阵列筛选,评估组织范围内的细胞因子变化的小胶质细胞激活屏幕。后者是一个最敏感的和可重复性的手段来衡量多个细胞因子系统,同时信号的变化。重大变化,然后有针对性的qPCR蛋白质检测证实。我们探头组织为基础的细胞因子蛋白复微流式细胞仪检测使用Luminex公司的技术变化。确定双标免疫组化细胞特异性细胞因子的产生。两者合计,这个脑组织编制和使用的样式,再加上建议的调查战略可能是一个确定发展的新型疗法,可以模仿冷预处理的优势的潜在目标的最佳途径。
两个极其重要的概念,重要的是参与冷预处理神经保护作用的细胞因子信号系统的划分是在图6和7所示。首先,细胞因子的浓度极低,在正常脑组织中的信号分子。然而,生理细胞因子浓度的变化有一个巨大的可能改变大脑结构和功能(即表型),因为他们有能力改变基因的表达(图6)。此外,细胞因子是高度冗余和多效性,多种细胞因子,可以有类似的效果,和一个单一的细胞因子可以变量的影响(图7)。因此,要准确地建立先天的神经保护作用的细胞因子冷预处理(或其他生理预处理刺激),必须确定相关的信令变量的综合分析基地。这是通过复用检测策略。这将建立的“签名”冷预处理神经保护作用的细胞因子。
图6。脑细胞因子信号的电源 。插图传达巨大的信号的脑细胞因子的生理浓度的力量,相比其他公认同行的浓度。浓度表示为距离的倒数,作为参考点的单猫须开始。钠(10 -1 m的一粒胡椒说明)和钾(10 -3 M说明了一个西红柿)是在约150个和3毫米,分别的水平间质性脑空间,并有公认角色神经细胞的电生理功能。同样,pH值(即〜10 -7 m层的氢离子和780米沿芝加哥的湖畔所示)和钙(即〜10 -8看到7.8公里,从谷歌卫星图像沿着芝加哥的麦考密克湖畔看到的水平地点在海德公园附近的芝加哥大学岬点)。此外,这些浓度间质空间释放的神经递质影响当地的大脑区域的活动。与此相反,细胞因子(从地球到火星的距离显示),可以改变浓度的脑功能少十几万次。
图7。互动信号与生俱来的细胞因子的途径。细胞因子是高度冗余,多种细胞因子多效可以有类似的效果,可以有一个单一的细胞因子变量的影响。这种多样性源于复杂的交互信号配体,受体和磷酸化水平发生。事实上,大脑的不同类型的细胞,每个先天细胞特异的细胞因子,受体,和相关的磷酸化变化的能力,组成更加复杂源于。这里说明的目的,只有天生的细胞因子信号转导通路(从免疫细胞研究中派生)所示。为了简便起见,绘制大脑是作为一个单一的细胞显示出与生俱来的细胞因子的潜在的相互作用(白线)(IL -1α和IL -1β(这里称为IL -1α/β),肿瘤坏死因子-α,IL – 6,干扰素γ和IL – 10),受体(IL – 1R1,TNFR1,IL-6/gp130,IFNγR,和IL – 10R)和磷酸化(即,P38(P38 – MAPK)和JNK激酶ERK1 / 2)和转录因子(ATF – 2,NFκB,和STAT3)。例如,TNF -α信号通过TNFR1 JNK,P38 MAPK和ERK1 / 2,从而引发通过ATF – 2基因的表达。 TNF -α也可直接通过改变基因表达NFκB的激活。总之,这些转录因子的激活唤起增加(箭头)和下降(钝端)所示的细胞因子及其受体的表达。更重要的是,这些途径表明,在一个细胞因子的变化(如TNF -α)的影响其他细胞因子(如IL -1β)的生产。因此,建立准确的冷预处理,必须确定相关的信令变量的综合分析的细胞因子神经保护基地。这将建立先天的“签名”冷预处理的细胞因子。 (图片编制的数据参考#25。)
The authors have nothing to disclose.
这项工作是由美国国家神经紊乱和中风研究所(NS – 19108),偏头痛研究基金会,和白理查德P. Kraig基金会的赠款。玛西娅体育Kraig女士的协助下,准备文化传媒和维护切片文化。我们感谢她的意见,并在本文的最后版本的修订叶莲娜Grinberg。
Preparation of Slice Cultures
Name of Reagent/Equipment | Company | Catalogue/Model Number | Yorumlar |
Millicell-CM tissue culture inserts (30 mm) | Thermo Fisher | PICM0-3050 | |
Basal Medium Eagle | Invitrogen | 21010 | |
Earle s Balanced Salt Solution | Sigma | E2888 | |
Horse serum | Invitrogen | 26050-088 | |
Glutamax | Invitrogen | 35050 | |
Gentamicin | Invitrogen | 15710-064 | |
Fungizone | Invitrogen | 15295 | |
D-glucose | Sigma | G8769 | |
BSL-1 fume hood | Baker | ||
McIlwain tissue chopper | Brinkmann | ||
Teflon disks | Brinkmann | 023-49-310-1 | |
Spatula | Thermo Fisher | 14-373-25A | |
Curved iris scissors | Fine Science Tools | 14091-09 | |
Long straight scissors | Fine Science Tools | 14002-14 | |
Long forceps | Thermo Fisher | 13-812-40 | |
Angled forceps | Fine Science Tools | 11808-02 | |
Short forceps | Thermo Fisher | 13-812-38 | |
#5 Inox forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
2 Iris spatulae | Fine Science Tools | 10094-13 | |
150 x 15 mm Petri dishes | Thermo Fisher | 08-757-148 | |
60 x 15 mm Petri dishes | Thermo Fisher | 08-757-100B | |
Wild M8 stereomicroscope | Wild Heerbrugg | ||
Gey s balance salt solution | Sigma | G9779 | |
Blak-Ray shortwave Ultraviolet measuring meter | UVP | J-225 | |
6-well Falcon culture dishes | Thermo Fisher | 08-772-1B | |
Neurobasal | Invitrogen | 21103 | |
B27 supplement | Invitrogen | 17504 | |
Gem21 Neuroplex | Gemini Bioproducts | 400-160-010 | |
Ascorbic acid | Sigma | A4544 | |
CO2 Analyzer | Bacharach | #2820 |
Pre-screening for Vitality of Slice Cultures
Name of Reagent/Equipment | Company | Catalogue/Model Number | Yorumlar |
Sytox Green | Invitrogen | S7020 | |
DMIBRE inverted microscope | Leica |
Cold-Preconditioning
Name of Reagent/Equipment | Company | Catalogue/Model Number | Yorumlar |
BSL-2 Fume Hood | NuAire |
Excitotoxic Injury
Name of Reagent/Equipment | Company | Catalogue/Model Number | Yorumlar |
CoolSnap fx CCD camera | Photometrics | ||
Fluoroscein | Invitrogen | F36915 | |
MetaMorph software | Molecular Devices | v. 7.5.04 | |
100 μm deep hemacytometer | Hausser Scientific | ||
N-methyl-D-aspartate | Calbiochem | 454575 | |
SigmaStat software | Systat Software Inc. | v. 3.5 |
Co-treatments applied with Cold-Preconditioning
Name of Reagent/Equipment | Company | Catalogue/Model Number | Yorumlar |
sTNFR1 | R & D Systems | 425-R1-050 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A-4503 |
RNA Isolation
Name of Reagent/Equipment | Company | Catalogue/Model Number | Yorumlar |
RNAlater | Ambion | AM7021 | |
Micro RNEasy Kit | Qiagen | 74004 | |
β-mercaptoethanol | Fisher | 03446-100 | |
Diposable 1.5 RNAse-free Pestle |
South Jersey Precision Tool and Mold, Inc. | 749521-1590 | |
RNasin | Promega | N261A | |
Tris[hydroxymethyl]aminomethane | Sigma | T3069 | |
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt hydrate | Sigma | #E7889 |
RNA Quantification
Name of Reagent/Equipment | Company | Catalogue/Model Number | Yorumlar |
RiboGreen Assay | Invitrogen | R11491 | |
Yeast tRNA | Invitrogen | 15401-011 | |
1.5 mL centrifuge tubes | USA Scientific | 16155500 | |
96-well fluorescent assay plate | Nunc | DK-4000 | |
96-well fluorescent plate reader | Tecan | Safire II |
Quantitative PCR
Name of Reagent/Equipment | Company | Catalogue/Model Number | Yorumlar |
iScript reverse transcription kit | Bio-Rad | 170-8891 | |
SYBR Green | Invitrogen | S7563 | |
Platinum Taq polymerase | Invitrogen | RNA Ultrasense 11732-927 | |
iCycler thermocycler | Bio-Rad | iCycler Optical Module | |
iCycler system software | Bio-Rad | v. 3.1 |
Quantitative PCR for Microarrays
Name of Reagent/Equipment | Company | Catalogue/Model Number | Yorumlar |
RNase Away | Molecular BioProducts | #7000 | |
RT2 First Strand Kit | SABiosciences | C-03 | |
SYBR Green-based PCR mix | SABiosciences | PA-011 | Specific for iCycler |
RT2 Profiler PCR Array | SABiosciences | PARN-011A |
Proteomic Assay
Name of Reagent/Equipment | Company | Catalogue/Model Number | Yorumlar |
Cell lysis kit | Bio-Rad | 171-304011 | |
Microcentrifuge | Fisher Scientific | Micro 7 | |
BSA protein stock | Bio-Rad | 500-0007 | |
BCA protein assay kit | Thermo Scientific | 23225 | |
Immuno 96 MicroWell plates | Nunc | 449824 | |
Sealing tape | Bio-Rad | 2239444 | |
96-well plate reader | Perkin Elmer | 1420-mulilabel counter | |
Bioplex Rat TNF-α cytokine assay | Bio-Rad | X0000001T |
Immunostaining
Name of Reagent/Equipment | Company | Catalogue/Model Number | Yorumlar |
16% Paraformaldehyde | Alfa Aesar | 43368 | |
Lysine | Sigma | L-6001 | |
Sodium phosphate | Fisher Scientific | S374-1 | |
Sodium periodate | Sigma | S-1878 | |
Sodium azide | Sigma | S-2002 | |
Hydrogen Peroxide (30%) | Sigma | H1009 | |
Goat serum | Colorado Serum Company | CS 0920 | |
Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
Staining dishes | Ted Pella, Inc. | 14511 | |
Plate Shaker | Lab-Line Instruments, Inc. | 3520 | |
#1 Filter Papers (185 mm) | Whatman | 1001-185 | |
3,3 -diaminobenzidine | Sigma | D8001 | |
Dimethyl sulfoxide | Sigma | D8418 | |
Ethanol | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
Xylene | Fisher Scientific | X3S-4 | |
Permount mounting media | Fisher Scientific | SP15-100 | |
Cryostat | Leica | cm3050 S | |
Tissue-Tek | Ted Pella, Inc. | 27050 | |
Fine-tip paint brush | Ted Pella | 11806 | |
PAP blocking pen | Ted Pella, Inc. | 22309 | |
SFX signal enhancer | Invitrogen | A31631 | |
ProLong Antifade | Invitrogen | P7481 |