1) Подготовьте лектин-сопряженных ПОРОС столбцов Наденьте маску для защиты от вдыхания ПОРОС-AL бисера во время шага 1.1 – 1.2. Отвесить нужное количество бусин ПОРОС (100 мг beads/300 мкл конечного объема) и передача в чистую пробирку Эппендорф. Вымойте бисера с добавлением 1 мл фосфатно-солевом буфере (PBS). Гранул бисером центрифугированием в микроцентрифужных на максимальной скорости в течение 3 минут. Удалить супернатант и повторите мыться. Отвесить нужное количество неконъюгированного лектина (1 – 4 мг / 200 мкл бусы) и трансфер в чистую пробирку Эппендорф. Добавить PBS для формирования 5 – 20 мг / мл раствора. Резервный 25 мкл этого раствора. Передача оставшийся раствор лектина к ПОРОС бисером. Добавить цианоборогидрида натрия в конечной концентрации 50 мМ. Место трубки на рокера и реагировать на ночь при комнатной температуре. (Примечание:. Цианоборогидрида натрия является токсичным и должны быть обработаны в вытяжной шкаф загрязненные отходы должны быть утилизированы соответствующим образом.) Гранул ПОРОС бисером, как в пункте 1.2. Удалить супернатант и сохранить как после конъюгации решение. Вымойте бисер с 1 мл буфера Тушение (1 М Трис-Cl, рН 7,4). Гранул бисером, как в пункте 1.2 и безопасно отбросить супернатант. Блок оставшиеся реактивной сайтов бисером ПОРОС с 1 буфера Тушение мл. Добавить цианоборогидрида натрия в конечной концентрации 50 мМ. Место трубки на рокера и инкубировать при комнатной температуре в течение 30 мин. Гранул бисером, как в пункте 1.2 и отбросить супернатант. Вымойте бисер с 1 мл 1 М NaCl. Гранул бисером и отбросить супернатант. Повторите четыре раза для общей сложности пять стирок. Бусины готовы к упаковке. Для определения количества белка, что было сопряжено с ПОРОС бусы, выполнять анализ концентрации белка на предварительно сопряженных и пост-сопряженные решения лектина. Различие в концентрациях количество белка, что было сопряжено с бисером. Количество белка в сопряженных бусинка объем равен концентрации лектина на бусы. Целевые концентрации лектина составляют от 2 -20 мг / мл. 2) Упаковка лектин-сопряженных ПОРОС бисером в колонке PEEK Сборка системы упаковки (описание ниже) и поддерживать его на подставке металлическим кольцом. Упаковка система состоит из, снизу вверх, давление ограничитель, конец колонки ответвитель 1, фритты, колонки (2 х 50 мм), в конце колонки ответвитель 2, колонка разъем, конец колонки ответвитель 3, колонка (4,5 х 50 мм), конец колонки 4 муфта и конец арматуры. Верхняя колонка служит резервуаром для упаковочного материала. Ресуспендируют ПОРОС бусины требуемого объема буфера (10 мМ трис-буфер, рН 7,4, 150 мМ хлорида натрия, 10 мМ хлорида кальция, 10 мМ хлорид магния). Если упаковка одного столбца (~ 200 мкл кровать), ресуспендируют в 400 мкл буфера А. Передача сопряженных бисером ПОРОС в верхней колонне (резервуар). Добавить буфера в резервуар, пока буфер достигает верхней части колонны. Аккуратно конце установки на верхней части колонны, стараясь избегать пузырьков воздуха в колонне. Подключите конец установка верхней колонки системы ВЭЖХ. Обновления колонки течет буфера через систему. Начните с расходом 0,5 мл / мин. Увеличение скорости потока на 0,5 мл / мин с каждой минутой, пока не 4 мл / мин или максимальное давление (3000 фунтов на квадратный дюйм), была достигнута. Продолжить на максимально возможной скорости потока по крайней мере до 35 мл буфера прошли через колонки. Выключите насос и дать давление на колонке, снизится до <20 фунтов на квадратный дюйм. Осторожно, не разбирайте упаковки системы, начиная с самого верха. Когда муфта конца столбец 2 будет достигнута, удалить осторожно. Некоторые упакованные материалы должны быть выдавливания из верхней части колонны. С лезвия бритвы или аналогичного острые края, аккуратно вытереть экструзии бусы, оставляя поверхность шва, который даже с верхней части колонны. Не давите на бисер, делая это. Отрыв насадочной колонне из кольца стенда. Место новые фритты в новый ответвителя конца и поверните насадочной колонне более связывать это с фритта / конец муфты на открытом (ранее сверху) колонки конца. Этикетка колонки соответственно. В настоящее время готова к использованию. Когда вы не пользуетесь, колонки могут храниться в PBS с 0,02% азида натрия при температуре 4 ° С не более 6 месяцев. 3) Программа методом высокоэффективной жидкостной хроматографии Подробностями программирования вашего ВЭЖХ будет варьироваться в зависимости от особенностей программного обеспечения фирмы-производителя. Мы используем Paradigm Michrom MG4 ВЭЖХ. На этой машине, методы строятся и доступен в разделе "Настройки", расположенную в верхней части экрана. Программа следующий метод: Время Расход (мкл / мин) % % B 0:00 50 100 0 9:00 50 100 0 9:01 500 0 100 13:50 500 0 100 13:51 3000 100 0 19:50 3000 100 0 Буфер: 10 мМ трис-буфер, рН 7,4, 150 мМ хлорида натрия, 10 мМ хлорида кальция, 10 мМ хлорид магния Буфер B: 0,5 М уксусной кислоты УФ-детектор должен быть запрограммирован на чтение при 280 нм с 0:00 до 19:50. Оси ординат должен быть отрегулирован для обнаружения низких уровней поглощения, например, 0 – 50. АС. Если автосамплером доступна, программа следующему графику для фракции коллекции. В противном случае, собирают фракции вручную, как указано при выполнении хроматографии. Фракция Задержка со сбором от образца инъекции Продолжительность сбора (мин) Проточная 2,8 4,1 Связанный 9 2,6 4) Подготовка проб для ВЭЖХ Перед использованием в данном протоколе, плазмы крови человека должны быть исчерпаны из 14 наиболее обильных белков на колонке MARS (Agilent, Санта-Клара, Калифорния). Обедненный плазмы, лактоферрина человека и дрожжей инвертазы должны быть индивидуально трипсин-переваривается и обессоленной, как описано выше 1. Для подготовки лектина конкретных лактоферрин стандарт, выполняют хроматографии на 50 мкг трипсина-переваренной лактоферрин как за AAL или колонки СНС методом в части 3. Связанной фракции будет содержать лектина конкретных лактоферрин гликопептидов. Нейтрализовать образцов, как в части 4.4 и опреснения, как в части 6. Ресуспендируют образца в 1 мл буфера А. Полученный образец будет готов к использованию. Три экспериментальных повторяет будет выполнена. Для подготовки образцов в течение трех повторяет, добавить 3 пмоль трипсина-переваренной инвертазы и 1 мкл лектина конкретных лактоферрин (либо AAL-ЛАК или СНС-ЛАК) до 30 мкл МАРС-истощаются, трипсин-переваривается, плазменные эквиваленты (PE). ПЭ определяется как объем non-processed/intact/original плазмы, из которой данное количество обработанных плазмой (МАРС-истощены и трипсина переваривается) было получено. Добавить буфера в образец для достижения конечного объема 330 мкл. Добавить нейтрализации буфера (1 М Трис рН 8,0), к образцу флаконов, что будет собирать элюат. Количество и объем флаконов вы работаете с, будет зависеть от ограничений вашего автоматического пробоотборника. Для Paradigm MG4, один флакон собирает проточные и два сбора элюата. Это потребует примерно 1,5 мл трис-буфера для нейтрализации 1 мл элюата. Целевая нейтрализованы рН 7,0-8,0; тест тест окончательного рН с рН индикаторной бумаги. 5) Выполните хроматографии Все пустое и пример работает, следующие будут использовать метод, описанный в Части 1. Столбца и буферы при комнатной температуре при ее использовании. Колонны хранить при температуре 4 ° С, а буферы хранятся при комнатной температуре. Прикрепите либо AAL или колонки СНС лектина в систему ВЭЖХ и запустить две пустые методы (потребители инъекционных только буфера). Убедитесь, что лектин столбец соответствует лектина конкретных лактоферрин (Часть 2). Хроматограф трех образцов плазмы, потребители инъекционных пустым между каждой инъекции образца, на общую сумму 7 работает ВЭЖХ. Фракции из пустых работает не обязательно должны быть собраны. 6) опреснения собранных фракций Для каждой фракции использовать один 1 мл воды Оазис HLB SPE картридж следующим образом: Прикрепить количество необходимых патронов к вакуумным многообразием. Влажные каждый картридж с 1 мл 80% ACN в 1% муравьиной кислоты (вакуумметр на многообразии должны прочитать 5 – 20 lnHg). Равновесия патроны с 1,5 мл 0,1% муравьиной кислоты (вакуумметр на многообразии должны прочитать 5 – 20 lnHg) Нагрузка весь объем одной пробы на один картридж (Вакуумметр на многообразии должны прочитать 2 – 2.5. LnHg, а скорость потока не должна превышать 1 мл / мин) Вымойте патроны с 3 х 1 мл 0,1% муравьиной кислоты (Вакуумметр на многообразии должны прочитать 5 – 20 lnHg) Элюции пептидов / гликопептидов в подписанные Эппендорф труб с 1 х 1 мл 80% ацетонитрила в 0,1% муравьиной кислоты. (Вакуумметр на многообразии должны прочитать 2 – 2,5 lnHg, а скорость потока не должна превышать 1 мл / мин.) Одной трубой сбор должен быть использован для каждого картриджа. Нейтрализовать элюата, добавляя 60 мкл 0,5 М бикарбонат аммония в каждой коллекции трубки. Целевая нейтробобщенные рН является 7,0-8,0; тест окончательного рН с рН индикаторной бумаги. Концентрат элюировали пептиды / гликопептидов до ~ 50 мкл, запустив их в вакуумной центрифуге (например, Thermo Savant SpeedVac) для ~ 2 часа при 35 ° C. 7) PNGase F-пищеварение Испытание образца рН для обеспечения его между 7,0 – 8,0. Если нужно, добавьте 50 мМ бикарбоната аммония увеличения рН. Если конечный объем пробы> 100 мкл, speedvac образца, пока он находится между 50-100 мкл. Добавить 0,5 мкл (250 U) глицерина, свободных F PNGase в каждую пробирку образца и инкубировать при температуре 37 ° С в течение ночи. 8) образцы Zip Совет Начиная с PNGase F-переваривается образцов, каждый из ziptip следующим образом. Влажные ziptip по 10 мкл 100% ацетонитрила, затем 10 мкл 80% ацетонитрила, 0,1% муравьиной кислоты. Равновесия ziptip с 20 мкл 0,1% муравьиной кислоты. Нагрузка на образец ziptip пипетированием его вверх и вниз через матрицу ziptip 10 раз. Вымойте ziptip с помощью пипетки 10 мкл 0,1% муравьиной кислоты, 5 раза. Элюировать образца в чистую пробирку Эппендорф с 10 мкл 80% ацетонитрила, 0,1% муравьиной кислоты. Повторите элюирования и добавить второй 10 мкл в ту же трубу. Speedvac образцы объема <2 мкл. Ресуспендируют образцов в 20 мкл 0,1% муравьиной кислоты. Образцы теперь готовы для анализа LC-MS/MS. 9) представитель Результаты: Сопряжения ПОРОС обычно дает на борт лектина концентрации в диапазоне 2 – 20 мг / мл. Это оптимально для аффинной хроматографии. Лектин хроматографии трипсина-переваренной МАРС-обедненного плазме крови человека обычно обогащает гликопептидов в связанной фракции. Как гликопептиды PNGase F обработанных до LC-MS/MS, они идентифицируются как пептиды с N-связанных консенсусной последовательности, NXS / T (где Х-либо остатка, но пролин), в котором аспарагин был преобразован в аспарагиновой кислоты за счет действия PNGase пептиды Ф. с этими характеристиками считаются deglycosylated пептидов (или "deglycopeptides"). В среднем проточные (FT) фракции из AAL или СНС хроматографии содержит 2-4% deglycopeptides, тогда как 30-50% пептидов взысканы в связанной фракции являются deglycopeptides. Как правило, с использованием QStar Elite, 1000-1300 пептиды будут определены во фракции ФТ и 200-400 пептидов, будут определены в связанной фракции. Два или более различных deglycopeptides инвертазы должны соблюдаться во фракции FT и две или более различных deglycopeptides лактоферрина в связанной фракции (табл. 1). Таблица 1.