Synthesizing Lipid Nanoparticles by Turbulent Flow in Confined Impinging Jet Mixers

Sai Nikhil Subraveti; Brian K. Wilson; Navid Bizmark; Jason Liu; Robert  K. Prud&#39;homme

doi:10.3791/67047

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Bioengineering

Sintesi di nanoparticelle lipidiche mediante flusso turbolento in miscelatori a getto a impatto confinato

Published: August 23, 2024

doi:

10.3791/67047

Sai Nikhil Subraveti¹, Brian K. Wilson¹, Navid Bizmark¹, Jason Liu¹, Robert K. Prud’homme¹

¹Department of Chemical and Biological Engineering,Princeton University

Summary

Viene dimostrato un protocollo dettagliato per la sintesi di nanoparticelle lipidiche (LNP) utilizzando tecnologie di miscelazione a getto a impatto confinato (CIJ), tra cui un CIJ a due getti e un miscelatore a vortice multi-ingresso a quattro getti (μMIVM). I miscelatori CIJ generano ambienti di micromiscelazione riproducibili e turbolenti, con conseguente produzione di LNP monodispersi.

Abstract

Le nanoparticelle lipidiche (LNP) hanno dimostrato il loro enorme potenziale come veicoli di somministrazione terapeutica, come evidenziato dall’approvazione e dall’uso globale di due vaccini a RNA messaggero (mRNA) per il COVID-19. Su piccola scala, le LNP sono spesso prodotte utilizzando la microfluidica; Tuttavia, i limiti di questi dispositivi ne precludono l’uso su larga scala. I vaccini contro il COVID-19 sono prodotti in grandi quantità utilizzando miscelatori turbolenti a getto a impatto confinato (CIJ). La tecnologia CIJ consente la produzione su scala di laboratorio con la certezza che possa essere scalata in base ai volumi di produzione. I concetti chiave nella miscelazione CIJ sono che la lunghezza e la scala temporale di miscelazione sono determinate dall’intensità della turbolenza nella cavità di miscelazione e che la formazione di nanoparticelle avviene lontano dalle pareti, eliminando il problema della deposizione sulle superfici e delle incrostazioni. Questo lavoro dimostra il processo di produzione di LNP utilizzando la tecnologia del miscelatore a getto a impatto confinato con due geometrie: il CIJ a due getti e il miscelatore a vortice multi-ingresso a quattro getti (MIVM). Vengono discussi i vantaggi e gli svantaggi di ciascuna geometria di miscelazione. In queste geometrie, le LNP sono formate dalla rapida miscelazione di un flusso di solventi organici (solitamente etanolo contenente lipidi ionizzabili, co-lipidi e lipidi PEG stabilizzanti) con un flusso acquoso anti-solvente (tampone acquoso contenente RNA o DNA). Vengono presentati i parametri operativi per i miscelatori CIJ e MIVM per preparare LNP riproducibili con dimensioni, potenziale zeta, stabilità ed efficacia di trasfezione controllati. Vengono inoltre presentate le differenze tra le LNP realizzate con una scarsa miscelazione (soluzioni di pipettaggio) rispetto alla miscelazione CIJ.

Introduction

Le terapie basate sull’mRNA hanno un grande potenziale per il trattamento e la prevenzione di un’ampia gamma di malattie, tra cui malattie infettive, malattie genetiche e tumori¹. A differenza delle terapie a piccole molecole, che possono diffondersi passivamente attraverso la membrana cellulare, gli acidi nucleici devono essere incapsulati per la consegna intracellulare². L’incapsulamento fornisce struttura e stabilità all’mRNA, facilitando la loro consegna intracellulare attraverso le vie endocitiche e prevenendo la degradazione da componenti intra ed extracellulari come le nucleasi³. Per l’incapsulamento e la somministrazione di mRNA sono stati sviluppati numerosi materiali e nanovettori, tra cui nanoparticelle inorganiche, polimeri, lipidi e materiali simili ai lipidi¹. Tra queste, le LNP sono emerse come la piattaforma di somministrazione più importante per le terapie basate su mRNA⁴.

Le LNP sono composte da quattro componenti lipidici: lipidi ionizzabili, colesterolo, lipidi zwitterionici e stabilizzatore lipidico PEG⁵. I lipidi ionizzabili adatti alla somministrazione di mRNA mostrano un attento equilibrio tra l’idrofobicità lipidica e la costante di dissociazione (pKa) di un gruppo amminico ternario⁶. Il lipide ionizzabile pKa ha tipicamente un pH compreso tra 6,0 e 6,7, come KC-2 (DLin-KC2-DMA), MC-3 (DLin-MC3-DMA) e ALC-0315⁷. Questa restrizione del pKa sul lipide ionizzabile consente sia l’incapsulamento di polimeri di acidi nucleici come sali lipidici idrofobici sia la consegna intracellulare attraverso un processo di “fuga endosoma”. Le LNP entrano in una cellula bersaglio attraverso (varie) vie di endocitosi che comportano tutte l’acidificazione dell’endosoma da pH 7,4 a pH ~5⁸. Il lipide ionizzabile pKa assicura che le LNP abbiano superfici quasi neutre in condizioni fisiologiche, ma diventino cationiche in un endosoma⁹ acidificante. Questa risposta al pH consente la rottura selettiva della sola membrana endosomiale, il rilascio del polimero di acido nucleico incapsulato e preserva la vitalità cellulare, a differenza dei lipidi permanentemente cationici utilizzati nei sistemi di trasfezione come la lipofectamina. Il colesterolo è una molecola interstiziale idrofobica nella struttura LNP che migliora la fluidità dei lipidi. Il lipide zwitterionico svolge un ruolo strutturale e forma un doppio strato sulla superficie dell’LNP. Il poli(glicole etilenico)-lipide (PEG-lipid) è uno stabilizzatore colloidale che migliora la stabilità dell’LNP impartendo uno stabilizzatore sterico polimerico sulla superficie dell’LNP, che resiste all’aggregazione degli LNP. Questo stabilizza l’LNP, in particolare durante le variazioni di pH che rigenerano la forma base libera del lipide ionizzabile che si comporta come un olio idrofobo. La ricetta di Onpattro (patisiran) (di seguito, indicata come formulazione LNP) è spesso utilizzata come punto di partenza per la formulazione di LNP con lipidi ionizzabili MC3, colesterolo, distearoilfosfatidilcolina (DSPC) e PEG2000-DMG disciolti in etanolo miscelato contro una soluzione acquosa di RNA¹⁰.

Diverse tecniche possono essere utilizzate per produrre LNP che incapsulano polimeri di acidi nucleici, la maggior parte delle quali si basa su un tema comune di miscelazione rapida di un flusso di etanolo contenente lipidi con un flusso acquoso che incorpora l’acido nucleico di interesse (siRNA, mRNA o DNA)9,11,12,13,14 . A questo proposito, i processi di miscelazione di massa come la miscelazione di pipette e la miscelazione a vortice offrono una strategia semplice per formare LNP che elimina la necessità di utilizzare strumenti sofisticati¹². Tuttavia, la miscelazione di massa non fornisce una distribuzione omogenea dei componenti, portando a una distribuzione delle dimensioni dell’LNP non ottimale insieme a una significativa variabilità da lotto a lotto¹⁵.

I laboratori utilizzano abitualmente tecniche di miscelazione microfluidica per ottenere LNP riproducibili ottenendo un controllo più preciso sulle condizioni di miscelazione 12,13,16. Tuttavia, le condizioni di flusso laminare nei dispositivi microfluidici, che sono intrinseche a causa delle piccole scale di lunghezza e delle basse velocità in una camera microfluidica, determinano una miscelazione solvente/antisolvente relativamente lenta¹⁷. Le piccole dimensioni della camera limitano fortemente la produttività e la scalabilità necessarie per la produzione GMP di LNP, ma i ricercatori hanno parallelizzato le camere microfluidiche per tentare di scalare i volumi di produzione¹⁵. Una geometria microfluidica parallelizzata non elimina il problema dell’adsorbimento dei lipidi sulle superfici durante la lavorazione di grandi volumi, un problema comunemente indicato come “incrostazione” del dispositivo di miscelazione, e ci sono problemi con l’uniformità e la stabilità dei flussi che rendono difficile lo scaleup della microfluidica per la produzione su scala industriale^18,19. Non sorprende che le aziende farmaceutiche abbiano utilizzato miscelatori a getto a impatto turbolento per produrre mRNA-LNP²⁰ per la vaccinazione COVID-19.

Il processo di produzione di LNP caricate con RNA comporta la miscelazione di un flusso tampone acquoso contenente il carico utile di RNA con un flusso di etanolo contenente i quattro distinti componenti lipidici. Queste formulazioni utilizzano un tampone acido con un pH di 4,0 o inferiore, che carica il lipide ionizzabile quando i flussi acquosi ed etanolici si mescolano. I lipidi ionizzabili caricati positivamente interagiscono elettrostaticamente con gli RNA caricati negativamente, formando un sale idrofobico di RNA-lipidi. Le specie lipidiche idrofobe, incluso il sale RNA-lipidico, precipitano nei solventi misti e formano nuclei idrofobici. Questi nuclei crescono attraverso la precipitazione del lipide zwitterionico e del colesterolo fino a raggiungere un punto critico in cui una quantità sufficiente di lipidi pegilati si adsorbe sulla superficie delle LNP, arrestando l’ulteriore crescita – nucleazione e meccanismo di crescita 21,22,23. L’aggiunta di tampone acquoso alla soluzione lipidica, nella misura in cui i lipidi precipitano e si formano le LNP, dipende da due scale temporali distinte: il periodo di miscelazione solvente-antisolvente, τ_mix, e il periodo di crescita dei nuclei, τ_agg. Il numero di Damköhler adimensionale, definito come Da = τ_mix/τ_agg, cattura l’interazione tra queste scale temporali²⁴. Nei casi di miscelazione lenta (Da > 1), la dimensione finale delle LNP è controllata dal trasporto e varia con il tempo di miscelazione. Al contrario, durante la miscelazione veloce (Da < 1), il fluido viene frammentato in striature o strati della lunghezza di Kolmogrov, per cui la formazione di LNP è governata esclusivamente dalla diffusione molecolare di ciascun costituente, risultando in una cinetica omogenea di formazione di LNP. Il raggiungimento di quest'ultimo scenario richiede che la concentrazione lipidica superi una soglia critica, stabilendo uno stato di sovrasaturazione che favorisca una nucleazione omogenea uniforme.

Si stima che τ_agg vada da poche decine a poche centinaia di millisecondi²⁵. Nella sua configurazione più elementare, i due flussi, uno contenente etanolo con lipidi e l’altro contenente un tampone acquoso con carico di RNA, vengono iniettati in una camera nota come miscelatore a “getto a impatto confinato” (CIJ). I vortici turbolenti producono scale di lunghezza della striatura solvente/antisolvente di 1 μm entro 1,5 ms se azionati a velocità appropriate. Le velocità dei flussi e la geometria di miscelazione determinano la conversione della quantità di moto lineare in vortici turbolenti che mescolano i flussi. Questo è parametrizzato dal numero adimensionale, il numero di Reynolds (Re), che è linearmente proporzionale alle velocità del flusso. Re è calcolato da Re = Σ (V_iD_i/v_i), dove V_i è la velocità del flusso in ogni vapore, v_i è la viscosità cinematica di ciascun flusso e D_i è il diametro dell’ingresso del flusso nei dispositivi CIJ a 2 getti²⁶ o il diametro della camera nei MIVM a 4 getti²⁷. Nota: Alcuni riferimenti per il CIJ utilizzano solo un singolo diametro e velocità del getto per definire Re²⁸. Re è nell’intervallo da 1 a 100 in un dispositivo microfluidico, mentre nei dispositivi CIJ è possibile raggiungere un Re di 125.000. In un miscelatore CIJ, i flussi con la stessa quantità di moto si scontrano, dissipando la loro quantità di moto all’impatto come miscelazione turbolenta, che porta a una micromiscelazione efficiente grazie alle piccole microscale di Kolmogorov e al piccolo numero di Damköhler. Un altro tipo di miscelatore è il “miscelatore a vortice a ingresso multiplo” (MIVM), in cui quattro flussi sono diretti in una camera centrale. In questa configurazione, i flussi continui nella camera di miscelazione confinata garantiscono una scala temporale di miscelazione ben definita. Tutti gli elementi fluidi passano attraverso la zona di miscelazione ad alta energia in entrambi i tipi di miscelatori. Al contrario, i dispositivi di miscelazione semplici come le giunzioni a T non contengono una camera che fornisce una zona di miscelazione, con conseguente minore miscelazione dei due flussi a causa del momento del flusso in entrata che viene in gran parte deviato nella direzione di uscita piuttosto che nella generazione di vortici turbolenti. Sia i miscelatori CIJ che MIVM possono essere utilizzati in modalità batch o continua, offrendo flessibilità per la produzione di LNP su varie scale.

Questo protocollo descrive come vengono realizzate le formulazioni ottimali di LNP impiegando due tecnologie di getto a impatto confinato: i miscelatori CIJ a 2 getti e i miscelatori MIVM a 4 getti. Il funzionamento dei miscelatori CIJ e MIVM è stato precedentemente dimostrato per la preparazione di NP con materiali di base idrofobici²⁹. L’articolo e il video dovrebbero essere consultati come risorsa aggiuntiva sulla formazione di NP con questi miscelatori. Questo aggiornamento si concentra sulla formazione di NP a base lipidica. Viene dimostrata la capacità di regolare le dimensioni delle LNP variando le condizioni di micromiscelazione. Inoltre, è stata dimostrata l’utilità delle tecnologie CIJ nella formazione di LNP stabili e monodisperse con migliori efficienze di trasfezione in vitro nelle cellule HeLa rispetto alle LNP prodotte utilizzando una scarsa miscelazione delle pipette. Inoltre, vengono discussi i vantaggi e gli svantaggi di ciascuna geometria di miscelazione CIJ, insieme alle condizioni appropriate necessarie per lo scaleup di questi miscelatori.

Protocol

I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella tabella dei materiali. 1. Preparazione di tamponi, flussi di solventi e antisolventi Sciogliere tutti i componenti lipidici in etanolo a determinate concentrazioni di massa, come mostrato nella Tabella 1, per ottenere una formulazione di LNP patisiran10. Prima dell’uso, riscaldare le soluzioni a 37 °C con una sonicazione delicata per sciogliere nuovamente i solidi precipitati.NOTA: È possibile preparare e conservare soluzioni madre più grandi di diversi millilitri a 4 °C. Preparare una soluzione madre tampone di acetato a una concentrazione di 100 mM, pH 4, combinando 186 mg di acetato di sodio e 464 mg di acido acetico in 80 mL di acqua priva di nucleasi. Regolare il pH con HCl o NaOH concentrato secondo necessità e portare il volume finale a 100 ml. Preparare una soluzione tampone madre HEPES a una concentrazione di 1 M, pH 7,5, sciogliendo 23,82 g di sale HEPES in 80 mL di acqua priva di nucleasi. Regolare il pH con HCl o NaOH concentrato secondo necessità e portare il volume finale a 100 ml. Diluire il polimero dell’acido nucleico di interesse e il tampone acetato da 100 mM con acqua priva di nucleasi per produrre una soluzione di RNA da 300 μg/mL in tampone acetato da 30 mM. Preparare un volume adeguato di soluzione di lavoro per gli esperimenti progettati e questo protocollo richiede 1500 μl in totale sia per i mixer CIJ che per MIVM.NOTA: L’RNA ottenuto dal fornitore sarà già in un tampone appropriato, tipicamente a una concentrazione di 10 mg/mL (RNA di lievito) o 1 mg/mL (mRNA codificante la luciferasi, LucRNA o mRNA codificante la GFP, GFP-RNA). L’RNA del lievito può essere utilizzato come RNA modello a basso costo per le precipitazioni. 2. Formulazione di LNP utilizzando un miscelatore CIJ a due getti Preparazione e pulizia delle attrezzaturePulire i miscelatori CIJ immediatamente prima dell’uso sciacquando il miscelatore con etanolo. Riempire due siringhe da 5 ml con etanolo e bloccarle in una porta di ingresso del CIJ. Premere rapidamente le siringhe e raccogliere l’effluente del miscelatore come rifiuto.NOTA: I miscelatori CIJ possono essere costruiti e utilizzati come descritto in precedenza29. Per sostenere il mixer CIJ possono essere utilizzati vari supporti di supporto, tra cui un supporto ad anello, un supporto per provette da centrifuga o un pallone di Erlenmeyer. I fornitori CIJ sono elencati nella Tabella dei Materiali e nel File Supplementare 1. Rimuovere le siringhe di lavaggio dell’etanolo dal CIJ. Queste siringhe possono essere conservate e riutilizzate per ulteriori risciacqui con etanolo della CIJ. Asciugare i canali interni di CIJ soffiando un flusso di azoto secco attraverso gli adattatori di ingresso. Se l’azoto non è disponibile, utilizzare solo aria secca e filtrata che non sia contaminata da nebbie d’olio della pompa o aerosol. Preparazione di flussi di solventi e antisolventiMiscelare le soluzioni madre lipidiche e diluirle con altro etanolo per produrre 500 μl della soluzione lipidica da 6 mg/mL elencata nella Tabella 1 in una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL.NOTA: Questa formulazione è la composizione di Onpattro comunemente usata contenente il 50 mole di MC3, il 10 mole di DSPC, il 38,5 mo% di colesterolo e l’1,5 mo% di DMG-PEG2000. Diluire il tampone tampone acetato 100 mM pH 4 a 10 mM in un volume totale di 4 mL come bagno di quench degli effluenti del miscelatore CIJ.NOTA: Al bagno di tempra può essere aggiunta anche un’ancoretta magnetica. Prelevare 500 μL di soluzione di RNA preparata al punto 1.4 in una siringa da 1 mL. Capovolgere la siringa ed espellere l’aria da questo flusso acquoso di antisolvente contenente polimero di acido nucleico. Prelevare 500 μl della soluzione lipidica preparata al punto 2.2.1 in una siringa da 1 mL. Capovolgere la siringa ed espellere l’aria da questo flusso di solvente etanolico contenente lipidi. Produzione di LNP in un miscelatore CIJPosizionare il miscelatore CIJ pulito sopra la fiala del bagno di tempra.NOTA: Un supporto ad anello clamp o una rastrelliera per tubi costituisce un comodo supporto per il mixer CIJ. Vedere la Figura 1A per una tipica configurazione CIJ. Accoppiare le due siringhe riempite al punto 2.2.3 e al passaggio 2.2.4 alle porte di ingresso del miscelatore CIJ. Premere rapidamente entrambe le siringhe per miscelare i flussi di solvente e antisolvente e raccogliere le NP lipidiche nel bagno di tempra.NOTA: le siringhe devono essere avanzate rapidamente (in meno di 1 s) ma in modo fluido e uniforme. Il flusso asimmetrico o il flusso lento produrranno LNP polidispersi e di grandi dimensioni. Rimuovere il miscelatore CIJ dal bagno di tempra con le siringhe ancora attaccate.NOTA: Non rimuovere le siringhe e non lasciare che il volume di ritenzione fluisca nel bagno di tempra, poiché questo materiale è scarsamente miscelato e avrà un impatto negativo sulle proprietà di dispersione della produzione se miscelato nel bagno di tempra. Tenere l’ICJ sopra un contenitore per rifiuti e rimuovere le siringhe, lasciando che il volume residuo di ritenzione fluisca nel contenitore per rifiuti. Smaltire queste siringhe e ripetere il processo di pulizia come descritto nel paragrafo 2.1. Analizzare le LNP prodotte con la CIJ come descritto nella sezione 5 di seguito. 3. Formulazione di LNP utilizzando un miscelatore MIVM a quattro getti Assemblaggio di un mixer MIVM, denominato MIVM di microdimensioni (μMIVM) per distinguerlo dai modelli più grandi utilizzati per la produzione su larga scalaRaccogli tutti i singoli componenti necessari per assemblare un mixer MIVM: il ricevitore inferiore, il disco della geometria di miscelazione, il disco superiore, l’O-ring e la chiave inglese.NOTA: La costruzione, l’assemblaggio e il funzionamento MIVM sono stati precedentemente dimostrati per l’incapsulamento di specie idrofobiche e i fornitori sono elencati nel File supplementare 1 e nella Tabella dei materiali29. Vedere la Figura 2 per uno schema dei componenti e la terminologia del supporto del mixer. Inserire l’O-ring nella scanalatura del disco di miscelazione. Allineare i fori del disco di miscelazione con i perni sul disco superiore e spingerli insieme senza spostare l’O-ring. Avvitare il disco di miscelazione accoppiato, l’O-ring e il gruppo disco superiore nel ricevitore inferiore senza stringere.NOTA: Rimuovere il tubo di uscita dal ricevitore inferiore prima di questo passaggio. Serrare il disco superiore nel ricevitore inferiore utilizzando la chiave inglese.NOTA: Se si osserva un grippaggio della filettatura, è possibile applicare un composto antigrippaggio alimentare o farmaceutico sulle filettature superiori del disco. Inserire e serrare il raccordo del tubo di uscita nel ricevitore inferiore per completare il MIVM. Montare il MIVM assemblato nel supporto del mixer in modo che il tubo di uscita esca attraverso la piastra di supporto.NOTA: La procedura di regolazione del supporto del mixer MIVM deve essere eseguita periodicamente per assicurarsi che i fermi meccanici sul supporto del mixer siano configurati correttamente29. Preparazione di flussi di solventi e antisolventiMiscelare le due soluzioni di flusso di solvente lipidico etanolico in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL, come indicato nella Tabella 2, diluendo le soluzioni madre lipidiche e aggiungendo ulteriore etanolo se necessario per raggiungere una concentrazione lipidica finale di 6 mg/mL.NOTA: Questa è la stessa composizione della soluzione lipidica di cui al punto 2.2.1 ma con un volume totale di 1000 μL. Diluire il tampone acetato da 100 mM pH 4 a 10 mM in un volume totale di 8 mL come bagno di quench degli effluenti MIVM.NOTA: Al bagno di tempra può essere aggiunta anche un’ancoretta magnetica. Formulazione di LNP mediante miscelatore MIVMPosizionare il bagno di raffreddamento da 8 ml sotto il supporto del miscelatore in modo che il tubo di deflusso si svuoti nel bagno di raffreddamento. Aspirare i flussi di solvente e antisolvente in siringhe a tenuta di gas da 1 ml utilizzando un ago a punta smussata. Rimuovere tutte le bolle d’aria e smaltire l’ago. Adescare ogni siringa capovolgendo ed espellendo l’aria dalla siringa. Montare le quattro siringhe sul miscelatore in senso orario (Siringhe 1-4, Tabella 2) con gli stessi flussi sui lati opposti. Vedere la Figura 1B per lo schema dell’aspetto finale. Tenere l’alloggiamento del cuscinetto su entrambi i lati della piastra mobile. Evitare di appoggiare le dita sulla parte inferiore dell’alloggiamento, in quanto ciò rappresenta un pericolo di schiacciamento a causa degli arresti meccanici. Abbassare con cautela la piastra mobile fino a quando non si appoggia uniformemente sulle siringhe.NOTA: Gli stantuffi della siringa devono essere tutti alla stessa altezza prima dell’uso. Premere costantemente e dolcemente la piastra, con l’obiettivo di completare l’operazione in circa 0,5 s a 1 s per questi volumi di flusso. Tappare il bagno di tempra, che contiene la dispersione di LNP. Eseguire la pulizia del MIVM dopo l’uso, seguendo le istruzioni al punto 3.5 di seguito. Formulazione di LNP utilizzando un miscelatore MIVM azionato da una pompa a siringaAssemblare la MIVM come descritto nel passaggio 3.1. Preparare le soluzioni di solvente e antisolvente nella composizione desiderata e in un volume sufficiente per la dimensione della formulazione richiesta (Tabella 3).NOTA: Si tratta delle stesse composizioni dei flussi di antisolvente acquoso (passaggio 1.4) e solvente etanolico (passaggio 3.2.1), ma sono state ampliate per l’uso con i volumi di siringa più grandi nella Tabella 3. Caricare le soluzioni in siringhe a tenuta di gas con volumi di 20 mL e collegare il tubo in PTFE con un adattatore luer montato all’estremità. Adescare le siringhe e il tubo capovolgendo la siringa e il tubo ed espellendo l’aria. Montare le siringhe in una pompa a siringa e collegare le siringhe agli ingressi del miscelatore sul MIVM, come mostrato nella Figura 3A.NOTA: Il CIJ può essere azionato anche tramite pompe allo stesso modo, ma con una sola siringa antisolvente e flusso di solvente. Diluire il tampone stock di acetato pH 4 da 100 mM a 10 mM in un volume totale di 320 mL come bagno di quench dell’effluente MIVM. Posizionare il bagno di tempra sotto l’uscita MIVM. Impostare la portata volumetrica della pompa a siringa su 20 mL/min.NOTA: Le portate volumetriche possono essere variate da 2 mL/min a 40 mL/min impostando manualmente i valori sulla pompa a siringa per formare LNP con diverse condizioni di micromiscelazione. Avviare la pompa a siringa, ma lasciare che i primi 10 s di effluente fluiscano in un becher di scarico. Raccogliere l’effluente MIVM nel bagno di tempra dopo questo periodo di flusso di avvio di 10 secondi. Rimuovere e tappare il bagno di tempra contenente la dispersione di LNP effettuata alla portata volumetrica selezionata (20 mL/min).NOTA: Questa procedura può essere ripetuta per sintetizzare LNP a diverse velocità di flusso selezionando i volumi del bagno di tempra appropriati. Pulire la MIVM tra ogni esperimento (quando si modifica la portata) lavando almeno il doppio del volume del tubo di uscita per evitare la raccolta di LNP effettuata alla condizione di portata precedente prima di iniziare la successiva sintesi di LNP. Pulizia dell’attrezzatura dopo l’usoStaccare il mixer dal supporto tenendo attaccate le siringhe e tenerlo sopra un contenitore per rifiuti. Rimuovere le siringhe, lasciando defluire il volume di ritenzione nel contenitore. Quindi, tenere il gruppo miscelatore capovolto e utilizzare la chiave inglese per smontare il miscelatore. Sciacquare il tubo di scarico con solvente (ad es. etanolo) e asciugare con aria o azoto. Sciacquare la geometria di miscelazione con un solvente adatto, come acqua deionizzata o etanolo, quindi risciacquare con etanolo. Asciugare i componenti utilizzando un getto d’aria o azoto. Sciacquare l’O-ring con acqua deionizzata e asciugarlo.NOTA: Se l’O-ring sembra allungato o deformato, lasciarlo asciugare all’aria durante la notte prima di utilizzarlo. Mantenere un ampio stock di O-ring poiché sono parti di consumo. Se la forma non si riprende entro il giorno successivo, smaltire l’O-ring. Sciacquare accuratamente il disco superiore con solvente, utilizzando un getto d’aria o di azoto per asciugare la superficie e i raccordi della siringa. Sciacquare ogni siringa con un buon solvente (ad es. acqua deionizzata o etanolo). Applicare un risciacquo finale con etanolo e asciugare all’aria prima dell’uso successivo. 4. Post-elaborazione delle LNP Scambio di tamponi e rimozione dell’etanoloDializzare la dispersione di LNP con un tampone HEPES da 10 mM a pH 7,4 utilizzando una cassetta per dialisi di dimensioni adeguate con una cartuccia per dialisi con cutoff di peso molecolare da 20 kDa.NOTA: Questo passaggio rimuove il residuo di etanolo al 10% e aumenta il pH di dispersione sostituendo il tampone acetato con HEPES. Diluire il tampone HEPES stock da 1 M a 10 mM in un volume totale di 1 L. Caricare la dispersione di LNP in una cassetta per dialisi da 12 mL utilizzando una siringa e un ago. Immergere la cartuccia per dialisi nel tampone HEPES da 1 litro e agitare magneticamente il tampone esterno. Sostituire il tampone HEPES esterno dopo 3 ore e rimuovere la cartuccia di dialisi dopo altre 3 ore per un tempo di dialisi totale di 6 ore. Estrarre la dispersione di LNP dializzato dalla cartuccia di dialisi e gettare la cartuccia esaurita. Concentrazione in sospensione di LNP tramite ultracentrifugazionePipettare la sospensione in un filtro centrifugo di dimensioni adeguate con un MWCO di 100kDa30.NOTA: I filtri centrifughi sono disponibili in una gamma di dimensioni, comunemente da 0,5 mL a 12 mL. Centrifugare la dispersione a 2000 x g per 10-20 min (a temperatura ambiente) per aumentare la concentrazione di un fattore di circa 5-20x.NOTA: Durante la centrifugazione, controllare il campione ogni 5 minuti per assicurarsi che rimanga una quantità adeguata di liquido. 5. Caratterizzazione delle LNP Misure idrodinamiche del diametro con diffusione dinamica della luce (DLS)Erogare 750 μl o 900 μl della dispersione di LNP preparata (senza diluizioni) rispettivamente in una micro o in una cuvetta quadrata o in una micro-cuvetta di plastica.NOTA: I volumi più piccoli possono essere utilizzati anche in apposite cuvette. Impostare la viscosità appropriata per il solvente in cui sono disperse le LNP (ad esempio, 1,26 cP per una miscela di etanolo al 10% in volume). Raccogliere la luce retrodiffusa con un angolo di 173° a 25 °C, seguita dalla determinazione delle dimensioni dell’LNP utilizzando il modello di Stokes-Einstein e il primo cumulante dell’espansione della serie della funzione di correlazione di diffusione della luce come definito nel documento standard ISO 13321:1996 E. Ripetere le misurazioni almeno tre volte. Misure di potenziale zetaAggiungere ~800 μl di dispersione di LNP preparata in celle zeta-sizer capillari ripiegate.NOTA: Per evitare l’intrappolamento di bolle all’interno del canale capillare, metà del liquido viene erogato nelle cellule, tenuto capovolto e quindi ruotato. Ripetere le misurazioni almeno tre volte.NOTA: La conducibilità del tampone deve essere compresa tra 0,2 e 2 milliSiemens/cm per ottenere i migliori risultati. Misure dell’efficienza di incapsulamento (EE) tramite kit di quantificazione dell’RNA disponibile in commercioDiluire la quantità appropriata del tampone Tris-EDTA (TE) 20x a pH 7,5 fornito nel kit di analisi a una concentrazione di 1x utilizzando acqua priva di nucleasi. Preparare una soluzione Triton X-100 al 2% in peso. Diluire la quantità appropriata di dispersioni di LNP nel tampone 1x TE per ottenere una concentrazione di massa totale di circa 0,6 μg/mL per l’RNA, con un contenuto di etanolo inferiore a 0,2 vol%. Preparare campioni simili a quelli del passaggio precedente, ma contenenti lo 0,5% in peso di Triton X-100, che dissolve efficacemente le LNP, facilitando la differenziazione tra concentrazioni di RNA “libero” e totale rispettivamente in assenza e presenza di Triton X-100. Preparare quantità adeguate di soluzioni di RNA di controllo alle concentrazioni di 0 μg/mL, 0,1 μg/mL, 0,2 μg/mL, 0,4 μg/mL, 0,6 μg/mL, 0,8 μg/mL e 1,0 μg/mL nel tampone 1x TE.NOTA: Inizialmente potrebbe essere necessario diluire il kit di RNA. Ripetere il passaggio precedente ma allo 0,5% in peso Triton X-100. Diluire il colorante Ribogreen (fornito nel kit) 200 volte nel tampone 1x TE. Aggiungere volumi appropriati del colorante Ribogreen diluito a tutte le soluzioni di RNA di controllo e campioni preparati, con o senza Triton X-100. Il colorante deve essere diluito equamente sia nell’RNA di controllo che nelle soluzioni del campione a un fattore due. Di conseguenza, la diluizione totale del colorante è 400 volte superiore a quella della sua concentrazione originale nel kit di analisi. Mescola a vortice i contenitori. Preparare una piastra opaca a 96 pozzetti, non trattata, a fondo piatto per l’analisi in un lettore di piastre. Dispensa volumi di 100 μl di campioni e controlli di RNA in celle separate della piastra.NOTA: Osservare la formazione di bolle nelle soluzioni contenenti Triton X-100. Per ogni campione vengono condotte almeno tre repliche, che richiedono almeno 350 μl di campioni. Registra l’intensità della fluorescenza utilizzando il lettore di piastre a una lunghezza d’onda di eccitazione di 485 nm e una lunghezza d’onda di emissione di 528 nm, con una durata dell’illuminazione di circa 10 s per lettura. Non è necessario agitare.NOTA: L’EE è determinato da , dove Icon Tritone e Isenza Tritone rappresentano l’intensità di fluorescenza media di tre repliche di campioni con e senza Triton X-100, rispettivamente, e acon Tritone e asenza Tritone denotano la pendenza degli adattamenti lineari alle due curve di calibrazione medie con e senza Triton X-100, rispettivamente31.

Representative Results

Lo screening delle formulazioni ottimali di LNP può essere ottenuto rapidamente con quantità relativamente piccole di materiale utilizzando miscelatori turbolenti CIJ a due flussi, a condizione che vengano azionati a velocità appropriate. Un miscelatore μMIVM azionato da una pompa a siringa programmabile, come illustrato nella Figura 3A, viene utilizzato per evidenziare l’importanza di ottenere una micromiscelazione sufficiente, al di sopra di un numero critico di Reynolds, per formare piccole LNP monodisperse. La Tabella 3 contiene il riepilogo delle formulazioni utilizzate per la produzione di LNP e la configurazione del miscelatore segue il protocollo descritto nella fase 3.4. Le dimensioni delle LNP sono state caratterizzate dalla diffusione dinamica della luce (DLS) in funzione del numero di Reynolds. Come mostrato nella Figura 3B, oltre un Re critico di 5000, si osservano LNP piccoli e monodispersi. Inoltre, è possibile accedere a numeri di Reynolds elevati (~104-10 5) quando le siringhe vengono premute in modo uniforme con l’uso manuale o utilizzando il supporto di miscelazione (punto dati più a destra nella Figura 3B). Il supporto di miscelazione, mostrato nella Figura 2A, preme uniformemente tutte le siringhe contemporaneamente27. Di conseguenza, anche tali LNP hanno dimensioni ottimali. Con una miscelazione inadeguata (cioè troppo piccola di Re), si formano LNP più grandi. Foto rappresentative delle LNP formate a bassa (Foto 1) e alta Re (Foto 2) sono mostrate nella Figura 3B. I campioni realizzati a basso Re sono torbidi, indicando la presenza di grandi strutture di diffusione della luce colloidale (effetto Tyndall), ma le LNP formate ad alto Re appaiono chiare a causa della diffusione più debole e spostata verso il blu da colloidi più piccoli. I lipidi ionizzabili hanno diverse proprietà fisico-chimiche, che influenzano le proprietà fisico-chimiche delle LNP prodotte con formulazioni lipidiche altrimenti identiche. Per testare questo viene utilizzato un mixer CIJ (Figura 1A). La Tabella 4 elenca le formulazioni realizzate utilizzando due lipidi ionizzabili approvati dalla FDA: ALC-0315 e MC3. La Figura 4A mostra che le LNP prodotte a pH 5 da ALC-0315 sono ~80 nm, mentre le LNP prodotte utilizzando MC3 sono ~60 nm. Inoltre, a pH 5, le LNP MC3 hanno un potenziale zeta positivo (~28 mV), mentre le LNP ALC hanno un potenziale zeta neutro (<10 mV). Questa distinzione nella carica superficiale, così come nella dimensione complessiva delle LNP, deriva dal pKa dei due lipidi. MC3 ha un pKa più alto (6,44) rispetto a ALC0315 (6,09)32; pertanto, una frazione più elevata di lipidi MC3 viene caricata a pH 5. Entrambe le formulazioni contengono uno stabilizzatore lipidico PEG all’1,5 mol%; tuttavia, le LNP MC3 si stabilizzano a dimensioni più piccole a causa delle repulsioni elettrostatiche più grandi durante l’assemblaggio delle LNP durante l’aggregazione a diffusione limitata, che arresta la crescita alle dimensioni più piccole. Entrambe le formulazioni mostrano un’elevata efficienza di incapsulamento (>90%), come mostrato nella Figura 4B. La chimica dei lipidi è fondamentale per determinare le proprietà complessive e le prestazioni delle LNP e, pertanto, devono essere scelte con cura in base all’applicazione target. Le LNP realizzate utilizzando entrambe le geometrie del miscelatore turbolento (fase 2.3 e fase 3.3) hanno proprietà fisico-chimiche simili. Questo confronto è ulteriormente esteso alle LNP ottenute con tecniche di miscelazione scadenti, come la miscelazione di pipette sfuse, per illustrare ulteriormente la distinzione tra miscelatori turbolenti e tecniche di miscelazione non uniformi (Figura 1C). La Tabella 5 fornisce il riepilogo delle formulazioni utilizzate per la produzione di LNP, come mostrato nella Figura 5. Nel caso della tecnica di miscelazione con pipetta, volumi uguali di etanolo e flussi acquosi vengono miscelati rapidamente mediante pipettaggio su e giù per 15-20 s, seguito dal pipettaggio della miscela in un bagno tampone di acetato a pH 4. La Figura 5A mostra che le dimensioni delle LNP nel bagno tampone di acetato da 10 mM di quench (pH 4, 10 vol% di etanolo) sono sorprendentemente simili e piccole (~50 nm) indipendentemente dalla geometria del miscelatore utilizzata (CIJ o MIVM). Tuttavia, le LNP prodotte con la miscelazione con pipette sono due volte più grandi delle LNP prodotte con miscelatori turbolenti. Ciò dimostra che le LNP realizzate con diverse geometrie CIJ mostrano proprietà simili quando prodotte a velocità sufficientemente elevate (regime turbolento al di sopra del numero critico di Reynolds), mentre una scarsa miscelazione si traduce in LNP più grandi e polidisperse. Successivamente, le LNP vengono dializzate contro un tampone HEPES da 10 mM, pH 7,4 (volume 100x), per rimuovere l’etanolo e passare il pH a 7,4. Durante questo processo, c’è una certa fusione di LNP e una crescita fino a una dimensione leggermente più grande, come mostrato nella Figura 5A, che è in linea con il meccanismo di fusione ben studiato in letteratura33. Complessivamente, le LNP realizzate utilizzando miscelatori CIJ e MIVM sono inferiori a 100 nm, mentre le LNP realizzate utilizzando la miscelazione di pipette sono di circa 140 nm. Come mostrato nella Figura 5B, i potenziali zeta per queste formulazioni sono inferiori a 10 mV, indicando che sono tutti neutri a pH 7,4. Inoltre, tutti mostrano un’elevata efficienza di incapsulamento del >95% (Figura 5C). Pertanto, le LNP con proprietà fisico-chimiche ottimali possono essere facilmente prodotte utilizzando tecnologie di miscelazione turbolente. Le prestazioni di queste LNP sono valutate effettuando trasfezione in vitro in cellule HeLa. Il protocollo del saggio di trasfezione in vitro basato sulla luciferasi è adottato da una precedente pubblicazione34. La Figura 6A traccia la luminescenza (RLU) per 1000 celle per le tre formulazioni riassunte nella Tabella 5. La lipofectamina 3000 è usata come controllo positivo. È importante notare che la lipofectamina 3000 è generalmente utilizzata per le formulazioni di DNA; tuttavia, ha funzionato come un controllo adeguato in questi esperimenti. Le LNP realizzate con miscelatori CIJ a 2 getti e MIVM a 4 getti trasfettano molto meglio delle LNP realizzate con miscelazione con pipette. Anche se ci si aspetta che le particelle più grandi trasfettino meglio delle particelle piccole a causa del maggiore carico utile per LNP, le LNP realizzate utilizzando la miscelazione di pipette qui trasfettano in modo meno efficace. Ciò implica chiaramente che esiste una differenza significativa nelle strutture delle LNP realizzate con tecnologie CIJ rispetto alle LNP realizzate con miscelazione di pipette. Le efficienze di trasfezione delle LNP realizzate con mixer CIJ e MIVM sono sostanzialmente identiche. Lipofectamine 3000 mostra la più bassa efficienza di trasfezione. La Figura 6B valuta la tossicità delle LNP in vitro sulle cellule HeLa utilizzando un saggio di vitalità cellulare basato sul sale di resazurina di sodio35. Tutte le formulazioni mostrano una bassa citotossicità, esibita da alti livelli di vitalità cellulare quando vengono tracciate come percentuale di cellule vive rispetto al controllo che non ha alcun trattamento con nanoparticelle. Figura 1: Metodi di miscelazione per la produzione di LNP. (A) Il miscelatore a getto d’urto confinato a due getti (CIJ) che mostra una fotografia di un miscelatore trasparente e di un miscelatore in Delrin assemblato regolarmente utilizzato in laboratorio. (B) Il miscelatore a vortice a quattro getti a ingresso multiplo (μMIVM) che mostra una fotografia di un miscelatore trasparente e di una configurazione assemblata di miscelatori in acciaio inossidabile e Delrin. I flussi di ingresso per il miscelatore trasparente sono stati spostati ai lati del miscelatore per una migliore visualizzazione della geometria di miscelazione, mentre nel pratico miscelatore i flussi di ingresso entrano dall’alto. Sia il CIJ che il μMIVM funzionano con una velocità del liquido sufficiente a far sì che i flussi siano in regime turbolento e la miscelazione produce microscale di Kolmogorov più piccole di 1 μm, che consentono il raggiungimento della sovrasaturazione in ~1,5 ms. (C) La configurazione di miscelazione della pipetta è ampiamente utilizzata per preparare piccoli volumi di dispersioni di LNP mescolando soluzioni acquose ed etanoliche. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2: Vista espansa del μMIVM e del suo supporto di miscelazione. (A) ΜMIVM assemblato, con siringhe di vetro, sotto il supporto del miscelatore che facilita una depressione uniforme e rapida delle siringhe. Questa figura è riprodotta da Markwalter et al.29. (B) μMIVM smontato che mostra i componenti interni. Questa geometria di miscelazione è identica al miscelatore trasparente nella Figura 1B, tranne per il fatto che i flussi di ingresso entrano attraverso il disco superiore e non attraverso la superficie cilindrica laterale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3: L’aumento del numero di Reynolds in un miscelatore turbolento riduce il diametro idrodinamico delle LNP fino a un numero critico di Reynolds del plateau. (A) Rappresentazione schematica della pompa a siringa e della configurazione μMIVM utilizzata per controllare il numero di Reynolds nel miscelatore turbolento impostando le portate volumetriche del flusso. (B) Diametro idrodinamico LNP rispetto al numero di Reynolds nel MIVM. L’aumento del numero di Reynolds e della dissipazione dell’energia turbolenta migliora la miscelazione e porta a una miscelazione più omogenea, alla sovrasaturazione e alla crescita delle particelle. Al di sopra del numero critico di Reynolds, le dimensioni delle LNP rimangono costanti con l’aumentare delle velocità di flusso a causa della condizione Da<<1, ovvero il tempo di diffusione del solvente/antisolvente è più breve del tempo di assemblaggio delle NP. Le portate indicate sono le portate totali di tutti e quattro i flussi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4: Proprietà colloidali delle LNP prodotte con diversi lipidi ionizzabili. (A) Diametri idrodinamici e potenziali zeta di LNP prodotti con due diversi lipidi ionizzabili: ALC-0315 e MC3. Le misure vengono effettuate a pH 5 nel bagno di quench dopo la formazione di LNP. Le differenze nel pKa apparente dei lipidi ionizzabili influenzano le proprietà colloidali delle LNP. (B) Misure dell’efficienza di incapsulamento di entrambe le LNP (n = 3, le barre di errore rappresentano una deviazione standard). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 5: Proprietà colloidali delle LNP prodotte con diversi miscelatori che incapsulano l’mRNA della luciferasi utilizzando il lipide ionizzabile MC3. (A) Diametri idrodinamici delle LNP prodotte con miscelatori a 2 getti, 4 getti e pipette. Le misure vengono eseguite sia nelle condizioni acide del bagno di quench dopo la formazione di LNP (lato sinistro) sia dopo la dialisi in un tampone HEPES neutro (lato destro). La dimensione dell’LNP cresce durante la neutralizzazione del pH a causa della deionizzazione del lipide ionizzabile, portando alla fusione e alla crescita dell’LNP. Lo stabilizzatore lipidico-PEG arresta la crescita di questa coalescenza di particelle prima della formazione di precipitati di dimensioni micron. (B) Misure di carica superficiale (come potenziale ζ) su LNP dializzati nella condizione HEPES 10 mM, pH 7.4. Tutte le LNP sono entro 2 mV di 0 mV, il che indica che queste superfici di particelle sono neutre e hanno solo una quantità quasi non rilevabile di carica cationica. (C) Misure dell’efficienza di incapsulamento dopo la dialisi delle LNP (n = 3, le barre di errore rappresentano una deviazione standard). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 6: Trasfezione di cellule HeLa con LNP as-prepared. (A) Luminescenza dell’enzima luciferasi espresso dopo il trattamento con luciferina. (B) Vitalità delle cellule HeLa dopo l’incubazione con LNP. Le cellule non mostrano alcun cambiamento statisticamente significativo nella vitalità, come indicato da un test metabolico della resazurina (n = 4, le barre di errore rappresentano una deviazione standard). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Flusso(i) /Bagno di tempra Componente Formulazione Ceppo Volume Siringa 1 -Flusso di etanolo(6 mg/mL di lipidi totali) Lipidi ionizzabili (MC3) 50 mol% 50 mg/mL 0,5 ml Lipidi Zwitterion (DSPC) 10 mol% 5 mg/mL Colesterolo 38,5 mol% 5 mg/mL Lipidi pegilati (DMG-PEG2000) 1,5 mol% 4 mg/mL Siringa 2 -Flusso acquoso(0,3 mg/mL di RNA) RNA di lievito N/P 6 10 mg/mL 0,5 ml Tampone in acetato 20 mM, pH 4 100 mM, pH 4 Bagno di tempra Tampone in acetato 10 mM, pH 4 100 mM, pH 4 4 ml Tabella 1: Formulazione standard di patisiran LNP prodotta da un miscelatore CIJ. L’RNA del lievito viene utilizzato come RNA modello per questo protocollo. Tutte le soluzioni vengono disciolte molecolarmente e miscelate accuratamente prima di essere caricate nelle siringhe. Flusso(i) /Bagno di tempra Componente Formulazione Ceppo Volume Siringa 1 -Flusso di etanolo(6 mg/mL di lipidi totali) Lipidi ionizzabili (MC3) 50 mol% 50 mg/mL 0,5 ml Lipidi Zwitterion (DSPC) 10 mol% 5 mg/mL Colesterolo 38,5 mol% 5 mg/mL Lipidi pegilati (DMG-PEG2000) 1,5 mol% 4 mg/mL Siringa 2 -Flusso acquoso(0,3 mg/mL di RNA) RNA di lievito N/P 6 10 mg/mL 0,5 ml Tampone in acetato 20 mM, pH 4 100 mM, pH 4 Siringa 3 -Flusso di etanolo(6 mg/mL di lipidi totali) Lipidi ionizzabili (MC3) 50 mol% 50 mg/mL 0,5 ml Lipidi Zwitterion (DSPC) 10 mol% 5 mg/mL Colesterolo 38,5 mol% 5 mg/mL Lipidi pegilati (DMG-PEG2000) 1,5 mol% 4 mg/mL Siringa 4 -Flusso acquoso(0,3 mg/mL di RNA) RNA di lievito N/P 6 10 mg/mL 0,5 ml Tampone in acetato 20 mM, pH 4 100 mM, pH 4 Bagno di tempra Tampone in acetato 10 mM, pH 4 100 mM, pH 4 8 ml Tabella 2: Formulazione standard di patisiran LNP prodotta da un miscelatore MIVM. Un miscelatore MIVM utilizza quattro flussi: due solventi e due antisolventi. Possono essere utilizzati corsi d’acqua con momenti disuguali; Tuttavia, per questo protocollo vengono scelti flussi con momenti uguali. Flusso(i) /Bagno di tempra Componente Formulazione Ceppo Volume Siringa 1 -Flusso di etanolo(6 mg/mL di lipidi totali) Lipidi ionizzabili (MC3) 50 mol% 50 mg/mL 20 ml Lipidi Zwitterion (DSPC) 10 mol% 5 mg/mL Colesterolo 38,5 mol% 5 mg/mL Lipidi pegilati (DMG-PEG2000) 1,5 mol% 4 mg/mL Siringa 2 -Flusso acquoso(0,3 mg/mL di RNA) RNA di lievito N/P 6 10 mg/mL 20 ml Tampone in acetato 20 mM, pH 4 100 mM, pH 4 Siringa 3 -Flusso di etanolo(6 mg/mL di lipidi totali) Lipidi ionizzabili (MC3) 50 mol% 50 mg/mL 20 ml Lipidi Zwitterion (DSPC) 10 mol% 5 mg/mL Colesterolo 38,5 mol% 5 mg/mL Lipidi pegilati (DMG-PEG2000) 1,5 mol% 4 mg/mL Siringa 4 -Flusso acquoso(0,3 mg/mL di RNA) RNA di lievito N/P 6 10 mg/mL 20 ml Tampone in acetato 20 mM, pH 4 100 mM, pH 4 Bagno di tempra(Orario di ritiro= 30 s) Tampone HEPES 10 mM, pH 7,5 1 M, pH 7,5 320 ml Tabella 3: Formulazione di LNP prodotta da un miscelatore MIVM azionato da una pompa a siringa. Il DODMA è usato come lipide ionizzabile insieme all’RNA del lievito come RNA modello. Per questo protocollo viene scelto un esempio di esecuzione con 40 mL/min. Flusso(i) /Bagno di tempra Componente Formulazione Ceppo Volume Siringa 1 -Flusso di etanolo(12 mg/mL di lipidi totali) Lipidi ionizzabili (MC3 o ALC0315) 50 mol% 50 mg/mL 0,5 ml Lipidi Zwitterion (DSPC) 10 mol% 5 mg/mL Colesterolo 38,5 mol% 5 mg/mL Lipidi pegilati (DMG-PEG2000) 1,5 mol% 4 mg/mL Siringa 2 -Flusso acquoso(0,6 mg/mL di RNA) RNA di lievito N/P 6 10 mg/mL 0,5 ml Tampone in acetato 20 mM, pH 5 100 mM, pH 5 Bagno di tempra Tampone in acetato 10 mM, pH 5 100 mM, pH 5 9 ml Tabella 4: Formulazioni LNP da due diversi lipidi ionizzabili prodotti da un miscelatore CIJ. Le formulazioni sono realizzate in ALC-0315 o MC3, mentre tutti gli altri componenti sono mantenuti invariati. Flusso(i) /Bagno di tempra Componente Formulazione Ceppo Volume Siringa 1 -Flusso di etanolo(6 mg/mL di lipidi totali) Lipidi ionizzabili (MC3) 50 mol% 50 mg/mL 0,5 ml Lipidi Zwitterion (DSPC) 10 mol% 5 mg/mL Colesterolo 38,5 mol% 5 mg/mL Lipidi pegilati (DMG-PEG2000) 1,5 mol% 4 mg/mL Siringa 2 -Flusso acquoso(0,3 mg/mL di RNA) FLuc mRNA N/P 6 1 mg/mL 0,5 ml Tampone in acetato 20 mM, pH 4 100 mM, pH 4 Bagno di tempra Tampone in acetato 10 mM, pH 4 100 mM, pH 4 4 ml Tabella 5: Formulazione standard di patisiran LNP prodotta da un miscelatore CIJ. L’mRNA FLuc che esprime una proteina luciferasi viene impiegato per misurare l’espressione genica utilizzando un saggio di bioluminescenza. File supplementare 1: Fornitori di miscelatori CIJ e MIVM. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussion

E’ stata presentata la sintesi di LNP contenenti polimeri di acidi nucleici utilizzando due miscelatori turbolenti a getto confinato. Se condotti a velocità appropriate, i miscelatori turbolenti CIJ assicurano che la scala temporale di miscelazione sia più breve del tempo di assemblaggio delle LNP, producendo condizioni di supersaturazione omogenee per la formazione di piccole LNP con distribuzioni dimensionali strette²¹. Di conseguenza, le LNP realizzate con la stessa chimica utilizzando diverse geometrie di miscelatori turbolenti (il miscelatore CIJ a 2 getti e il miscelatore MIVM a 4 getti) mostrano proprietà fisico-chimiche simili e mostrano buone efficienze di trasfezione (Figura 5 e Figura 6). Al contrario, le LNP realizzate utilizzando il pipettaggio che produce una miscelazione più scarsa si traducono in LNP più grandi e più polidisperse (Figura 5A) con efficienze di trasfezione inferiori. È stato a lungo compreso che la cinetica di miscelazione e assemblaggio gioca un ruolo significativo nel trattamento delle LNP; Cullis et al. hanno notato che la rapida miscelazione convettiva-diffusiva di etanolo e tampone porta alla formazione di piccole particelle con una distribuzione dimensionale ristretta, mentre la miscelazione diffusiva lenta porta a particelle più grandi con ampie distribuzioni dimensionali⁹. La scala temporale della miscelazione nei miscelatori turbolenti CIJ diminuisce proporzionalmente alle portate in ingresso dei flussi al miscelatore²⁷. Questo è quantificato dal numero di Reynolds adimensionale (Re), che misura il rapporto tra le forze inerziali e viscose. La turbolenza all’interno delle camere di miscelazione del CIJ e del MIVM si verifica a Re sufficientemente alto, in modo tale che l’allungamento turbolento del vortice si traduca in piccole scale di lunghezza che producono una rapida miscelazione solvente/antisolvente per diffusione. La scala della lunghezza turbolenta dipende dal Re e non dalla geometria specifica del dispositivo di miscelazione. Questo è il motivo per cui il CIJ o il MIVM producono le stesse particelle LNP e perché le varie dimensioni dei miscelatori MIVM producono le stesse dimensioni NP²⁷. Ad alta Re, corrispondente ad alte velocità di ingresso, le LNP possono essere prodotte in modo riproducibile senza variazioni da lotto a lotto (Figura 3B).

Questo protocollo consente la formulazione di una varietà di LNP di mRNA, DNA o siRNA con diverse proprietà fisico-chimiche utilizzando miscelatori CIJ turbolenti. Oltre a consentire versatilità nella composizione e nelle concentrazioni, questa tecnica fornisce un percorso chiaro per selezionare rapidamente le formulazioni al banco vendita (pochi milligrammi) e scalare le formulazioni di piombo a lotti industriali di dimensioni maggiori a velocità di produzione di 5 L/min³⁶. Questo è stato un grosso ostacolo per molte altre tecniche, tra cui la miscelazione di massa e la microfluidica. Ad esempio, le tecniche di lavorazione di massa non riescono a produrre in modo coerente e riproducibile le LNP, anche su scale di pochi millilitri. Le tecniche microfluidiche forniscono un miglioramento significativo rispetto alle tecniche di miscelazione di massa per consentire la produzione di LNP uniformi e riproducibili; tuttavia, sono solo nell’ordine dei milligrammi²⁹. Come dettagliato nell’introduzione, la parallelizzazione dei dispositivi microfluidici fornisce un tentativo di scalare su scale di produzione, ma non elimina il problema delle incrostazioni e non può essere scalata con lo stesso successo dei miscelatori basati sulla tecnologia a getto a impatto confinato.

Oltre a questi vantaggi, i miscelatori CIJ saranno fondamentali per la produzione di LNP di prossima generazione che mostrano capacità di targeting o eseguono l’editing genetico. Le attuali formulazioni di LNP hanno lipidi e acidi nucleici che hanno diffusività simili e, pertanto, possono essere realizzate anche con una miscelazione leggermente scarsa su scala di banco. Tuttavia, gli approcci di editing genetico possono richiedere l’incapsulamento di specie di acidi nucleici con pesi molecolari molto diversi, come piccole molecole di RNA guida e grandi trascritti di mRNA, per codificare una proteina CAS9³⁷. Le scale temporali di diffusione molto diverse di queste diverse specie rendono difficile l’incapsulamento uniforme a rapporti stechiometrici. Questo problema dell’incapsulamento uniforme diventa più pronunciato man mano che l’efficienza di miscelazione diventa scarsa. Allo stesso modo, il targeting di cellule non epatiche potrebbe richiedere l’incorporazione di stabilizzatori a diffusione lenta fortemente legati (come copolimeri a blocchi di grande peso molecolare con ligandi mirati). I ligandi bersaglio fino a 14 kDa possono essere coniugati per bloccare i copolimeri prima dell’assemblaggio delle nanoparticelle, il che consente la loro incorporazione uniforme nelle NP utilizzando la miscelazione CIJ³⁸. I miscelatori turbolenti CIJ sono strumenti utili per la produzione di LNP realizzati con componenti aventi diverse diffusività.

Sebbene i miscelatori turbolenti CIJ dimostrino diversi vantaggi rispetto ad altri miscelatori per la formulazione di LNP, è importante notare le limitazioni associate a ciascuna geometria. Il miscelatore CIJ a 2 getti richiede che entrambi i flussi di ingresso (etanolo e acqua) abbiano momenti uguali (entro il 10%-30%) per ottenere una micromiscelazione turbolenta uniforme nella camera. Il fatto che il flusso di uscita sia composto da solvente/antisolvente 50:50 limita il livello di sovrasaturazione nella cavità di miscelazione in cui avviene la precipitazione²⁹. Questo inconveniente è affrontato dal miscelatore MIVM a 4 getti, in quanto può utilizzare quattro getti con momenti disuguali per ottenere condizioni di elevata sovrasaturazione nella camera di miscelazione. Inoltre, entrambi i miscelatori devono essere nell’ordine dei milligrammi di massa totale, il che li rende la scelta non ideale per lo screening ad alta produttività di molte diverse formulazioni di LNP. Per le formulazioni LNP semplici, lo screening può essere eseguito al meglio con la microfluidica o con strategie di pipettaggio su scala di microgrammi e quindi trasferito alla tecnologia a getto a impatto confinato quando sono state identificate alcune formulazioni di piombo. È inoltre fondamentale considerare i volumi morti nei miscelatori. Nel CIJ, due miscelatori a getto, i volumi di ritenzione sono di 50-100 microlitri. Questa quantità di materiale deve essere sottratta dalla quantità catturata nel bagno di tempra quando si calcola il recupero dal processo. Queste perdite sono insignificanti quando si opera su larga scala, ma rappresenterebbero il 10% delle perdite quando vengono prodotti volumi totali di 5 ml, come mostrato qui. I miscelatori turbolenti a getto d’urto sono uno strumento prezioso per la produzione di LNP su scala GMP, come evidenziato dai due vaccini COVID-19 approvati dalla FDA.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

NSF Fellowship to BKW (DGA1148900), supporto di Tessera Therapeutics Inc., Bill and Melinda Gates Foundation (BMGF, numeri di contratto OPP1150755 e INV-041182) e FDA nell’ambito del premio 75F40122C00186.

Materials

18:0 PC (DSPC)	Avanti Polar Lipids	850365P	Helper lipid
21 G x 1-1/2 in. BD PrecisionGlide Needle	BD	305167
96 Well Black Wall Black Bottom Plate	Fisher Scientific	07-000-135
96 Well White/Clear Bottom Plate, TC Surface	Thermo Fisher Scientific	165306
Acetic Acid, Glacial	Fisher Scientific	A38-212
ALC-0315	Avanti Polar Lipids	890900	Ionizable lipid
Amicon Ultra Centrifugal Filter, 100 kDa MWCO, 15 mL	Millipore Sigma	UFC910024
Amicon Ultra Centrifugal Filter, 100 kDa MWCO, 4 mL	Millipore Sigma	UFC810096
Bright-Glo Luciferase Assay System	Promega	E2620
Cholesterol	Millipore Sigma	C8667
CleanCap FLuc mRNA (5 moU)	Trilink Biotechnologies	L-7202
Confined Impinging Jets Mixer	Holland Applied Technologies, Helix Biotech, Diamond Tool and Die (DTD)	N/A	Contact Holland or DTD for custom orders and the Helix Biotech system is Nova BT. Review text for new mixer validation
D-Lin-MC3-DMA	MedChemExpress	HY-112251	Ionizable lipid
DMEM, high glucose, pyruvate	Thermo Fisher Scientific	11995065
DMG-PEG 2000	Avanti Polar Lipids	880151P	PEG-lipid
DODMA	Avanti Polar Lipids	890899P	Ionizable lipid
Ethanol 200 Proof	Decon Labs, Inc.	2701
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-959-70C
Falcon 50 mL High Clarity Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-959-49A
Fetal Bovine Serum, certified, United States	Thermo Fisher Scientific	16000044
HeLa	ATCC	CCL-2
HEPES, free acid	IBI Scientific	IB01130
HSW HENKE-JECT two-part 1 mL Luer	Henke Sass Wolf	4010.200V0
HSW HENKE-JECT two-part 5 mL (6 mL) Luer Lock	Henke Sass Wolf	4050.X00V0
Idex 1648 ETFE tubing ” OD 0.093” ID	Idex Health & Science	1648
Idex P-678 ¼”-28 to Luer fitting	Idex Health & Science	P-678
Idex P-940 ferrule for ETFE tubing	Idex Health & Science	P-940
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	Thermo Fisher Scientific	L3000001
Luer fitting	Idex Health & Science	P-604	Assemble on CIJ or MIVM mixer inlet with corresponding threads. Idex parts are also available through VWR and many other suppliers
Mixer stand	Holland Applied Technologies	N/A	See Markwalter & Prud'homme for design.²⁶ Contact Holland for Purchase
Multi-Inlet Vortex Mixer	Holland Applied Technologies and Diamond Tool and Die (DTD)	N/A	Contact Holland or DTD for custom orders. Review text for new mixer validation
O-ring (MIVM)	C.E. Conover	MM1.5 35.50 V75	Order bulk – consumable part. Ensure solvent compatibility if using an alternative source.
Outlet ferrule – CIJ	Idex Health & Science	P-200	Assemble with outlet fitting (large end flush with tubing)
Outlet fitting – CIJ	Idex Health & Science	P-205	Assemble with ferrule and tubing on CIJ chamber outlet
Outlet fitting – MIVM	Idex Health & Science	P-942	Combination with ferrule
Outlet tubing – CIJ	Idex Health & Science	1517	Use a tubing cutter for clean ends. Ensure extra tubing doesn't protrude into mixing chamber
Outlet tubing – MIVM	N/A	N/A	Fit to ferrule ID.
PBS – Phosphate-Buffered Saline (10x) pH 7.4, RNase-free	Thermo Fisher Scientific	AM9624
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
PHD 2000 Programmable Syringe Pump	Harvard Apparatus	N/A
Plastic two-piece syringe 1 mL	Thermo Fisher Scientific	S7510-1
Plug fitting	Idex Health & Science	P-309	Assemble on CIJ mixer sides (seal access point from drilling)
Quant-it RiboGreen RNA Assay Kit and RiboGreen RNA Reagent, RediPlate 96 RiboGreen RNA Quantitation Kit	Invitrogen by Thermo Fisher Scientific	R11491
Resazurin, Sodium Salt	Thermo Fisher Scientific	R12204
RNase AWAY Surface Decontaminant	Thermo Fisher Scientific	7000TS1
Scintillation vial	DWK Lifesciences	74504-20
SGE Gas Tight Syringes, Luer Lock, 100 mL	SGE	100MR-LL-GT
SGE Gas Tight Syringes, Luer Lock, 50 mL	SGE	50MR-LL-GT
Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 20 K MWCO	Thermo Fisher Scientific	66012
Sodium Acetate	Millipore Sigma	32319-500G-R
Sodium Hydroxide	Fisher Scientific	S320-500
Sucrose	Millipore Sigma	S7903-1KG
Syringe Filters, Sterile	Genesse Scientific	25-243
Triton X-100	Millipore Sigma	9036-19-5
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Thermo Fisher Scientific	25200056
Water, Endotoxin Free	Quality Biological	118-325-131	RNAse and DNAse free
Yeast RNA (10 mg/mL)	Thermo Fisher Scientific	AM7118

References

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Subraveti, S. N., Wilson, B. K., Bizmark, N., Liu, J., Prud’homme, R. K. Synthesizing Lipid Nanoparticles by Turbulent Flow in Confined Impinging Jet Mixers. J. Vis. Exp. (210), e67047, doi:10.3791/67047 (2024).

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