זיהוי מהיר של פתוגנים חיידקיים הגורמים לזיהומים בדרכי הנשימה התחתונות באמצעות הגברה איזותרמית בתיווך לולאה בתיווך שבב מיקרופלואידי
Summary
פתוגנים חיידקיים שונים עלולים לגרום לזיהומים בדרכי הנשימה ולהוביל לבעיות בריאותיות חמורות אם לא מזהים אותם במדויק ומטפלים בהם מיד. זיהוי מהיר ומדויק של פתוגנים אלה באמצעות הגברה איזותרמית בתיווך לולאה מספק ניהול ובקרה יעילים של זיהומים בדרכי הנשימה בסביבות קליניות.
Abstract
זיהומים בדרכי הנשימה (RTIs) הם בין הבעיות הנפוצות ביותר במסגרות קליניות. זיהוי מהיר ומדויק של פתוגנים חיידקיים יספק הנחיות מעשיות לניהול וטיפול ב- RTIs. מחקר זה מתאר שיטה לגילוי מהיר של פתוגנים חיידקיים הגורמים לזיהומים בדרכי הנשימה באמצעות הגברה איזותרמית רב-ערוצית בתיווך לולאה (LAMP). LAMP הוא כלי אבחון רגיש וספציפי המזהה במהירות חומצות גרעין חיידקיות בדיוק ובאמינות גבוהים. השיטה המוצעת מציעה יתרון משמעותי על פני שיטות גידול חיידקים מסורתיות, אשר גוזלות זמן רב ולעתים קרובות דורשות רגישות רבה יותר לאיתור רמות נמוכות של חומצות גרעין חיידקיות. מאמר זה מציג תוצאות מייצגות של זיהום K. pneumoniae וזיהומים משותפים מרובים שלו באמצעות LAMP כדי לזהות דגימות (כיח, נוזל שטיפת הסימפונות ונוזל שטיפה alveolar) מדרכי הנשימה התחתונות. לסיכום, שיטת LAMP רב ערוצית מספקת אמצעי מהיר ויעיל לזיהוי פתוגנים חיידקיים בודדים ומרובים בדגימות קליניות, אשר יכול לסייע במניעת התפשטות פתוגנים חיידקיים ולסייע בטיפול המתאים ב- RTIs.
Introduction
זיהומים בדרכי הנשימה (RTIs) הנגרמים על ידי פתוגנים חיידקיים תורמים בעיקר לתחלואה ולתמותה ברחבי העולם1. זה מוגדר כמו כל סימפטומים בדרכי הנשימה העליונות או התחתונות מלווה חום שנמשך 2-3 ימים. בעוד שזיהומים בדרכי הנשימה העליונות שכיחים יותר מזיהומים בדרכי הנשימה התחתונות, זיהומים כרוניים וחוזרים בדרכי הנשימה הם גם מצבים קליניים נפוצים, המהווים סיכונים גדולים לאנשים ומטילים עומס משמעותי על מערכות הבריאות2. פתוגנים חיידקיים נפוצים של RTI כוללים Streptococcus pneumoniae3, Haemophilus influenzae4, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Stenotrophomonas maltophilia, בין היתר. חיידקים פתוגניים אלה בדרך כלל מאכלסים את המשטחים הריריים של הלוע של הפונדקאי ודרכי הנשימה העליונות, וגורמים לתסמינים אופייניים של RTIs כגון כאב גרון וברונכיטיס. הם גורמים לדלקת ריאות כאשר הם מתפשטים מדרכי הנשימה העליונות לאזורים סטריליים של דרכי הנשימה התחתונות ועלולים להתפשט מאדם לאדם דרך דרכי הנשימה5. במקרים חמורים הם עלולים להוביל גם למחלות חיידקיות פולשניות, בעיקר דלקת ריאות חיידקית, דלקת קרום המוח ואלח דם, שהן סיבות מובילות לתחלואה ולתמותה בקרב אנשים בכל קבוצות הגיל בעולם.
בדיקות מסורתיות עבור RTIs כוללות תרבית מיקרוביולוגית באמצעות מקלוני גרון ודגימות נשימה כיח6. בנוסף, בדיקות סרולוגיות כגון בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים (ELISA) מזהות נוגדנים או אנטיגנים בסרום, בעוד בדיקות agglutination לבחון את תגובת agglutination של נוגדנים ואנטיגנים כדי לזהות זיהום7. תרבית מיקרוביאלית נחשבת לתקן הזהב לאבחון RTIs, אך שיעור החיוביות הנמוך שלה בתרביות, אמינות ירודה ומחזור זיהוי ארוך מגבילים את יעילות האבחון8. במציאות, אבחון מהיר ומדויק של RTIs הוא חיוני לחיסול מדויק של הפתוגן החיידקי. שיטות זיהוי מהירות ויעילות יכולות לסייע בהפחתת קצב ההעברה של פתוגנים, לקצר את משך ההדבקה ולהפחית שימוש מיותר באנטיביוטיקה 9,10. שיטות מבוססות ביולוגיה מולקולרית מזרזות באופן משמעותי את האיתור, כגון תגובת שרשרת פולימראז (PCR), המגבירה את רצף הדנ”א של גן המטרה כדי לזהות פתוגנים. עם זאת, PCR מסורתי דורש ציוד רכיבה בטמפרטורה מורכבת, וזה מסורבל וגוזל זמן. יתר על כן, כל הגברה של DNA באמצעות PCR (למעט PCR בזמן אמת) מסתיימת בהפרדה אלקטרופורטית של המוצר, שגם היא לוקחת זמן. הדמיה של המוצר דורשת צבעים, שרבים מהם מוטגניים או מסרטנים. לכן, הכרחי לפתח ללא הרף שיטות וטכנולוגיות חדשות לאבחון פתוגנים חיידקיים RTI.
הגברה איזותרמית בתיווך לולאה (LAMP) היא טכנולוגיה מולקולרית חדשנית ומתפתחת שפותחה לראשונה על ידי Notomi et al. בשנת 200011. LAMP יכול להגביר DNA בתנאים איזותרמיים יציבים ללא ציוד רכיבה מורכב בטמפרטורה, מה שהופך אותו מתאים לגילוי מהיר ומפחית את מורכבות הציוד ועלותו12. LAMP יכול לזהות ריכוזים נמוכים של DNA מטרה עם רגישות גבוהה13. הוא משתמש במספר פריימרים ספציפיים כדי לשפר את הסלקטיביות עבור רצפי מטרה ולהפחית את האפשרות של תוצאות חיוביות שגויות14. LAMP נמצא בהדרגה בשימוש נרחב במעבדות קליניות בשל הקלות, המהירות והפעולה האינטואיטיבית שלו, אפילו לגילוי RTIs. במחקר הזה חקרנו את היעילות של LAMP בזיהוי RTI נמוך יותר בדגימות קליניות (כיח, נוזל שטיפת סימפונות ונוזל שטיפה בנאדיות), כפי שמוצג באיור 1. ניכר כי LAMP מציע יתרונות כגון מהירות, רגישות וקלות שימוש על פני בדיקות מסורתיות בזיהוי RTI נמוך יותר, מה שהופך אותו ליישום מבטיח.
איור 1: המחשה סכמטית של שיטת זיהוי LAMP. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Protocol
Representative Results
Discussion
זיהומים בדרכי הנשימה הם זיהומים נפוצים הקשורים לבתי חולים, המטילים השלכות חמורות על חולים ומאמירים בשיעורי התמותה16. זיהוי מהיר ומדויק של פתוגנים פוטנציאליים ואחריו אנטיביוטיקה יעילה הוא המפתח לטיפול מוצלח ולשיפור הפרוגנוזה, במיוחד בהתחשב במגבלות הטבועות בשיטות תרבית מסור?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
הערכנו מאוד את התמיכה הכספית הניתנת על ידי קרן המחקר הבסיסית והיישומית של גואנגדונג (מענק מס ‘2022A1515220023) וקרן המחקר לכישרונות מתקדמים של בית החולים העממי המחוזי של גואנדונג (מענק מס ‘. KY012023293).
Materials
| Bath Incubator(MK2000-2) | ALLSHENG | Provide a constant temperature environment | |
| Bronchial lavage fluid collector head | TIANPINGHUACHANG | SEDA 20172081375 | Collecting bronchoalveolar lavage fluid |
| Fiberoptic bronchoscope | OLYMPUS | SEDA 20153062703 | A flexible bronchoscope equipped with a fiberoptic light source and camera, to visually examine the airways and structures within the lungs. Assist in collecting bronchoalveolar lavage |
HR1500- B2 |
Haier | SEDA 20183541642 | Biosafety cabinet |
| NAOH | MACKLIN | S817977 | Liquefy viscous lower respiratory tract sample |
| Nucleic acid detection kit for respiratory tract pathogens | Capitalbio Technology | SEDA 20173401346 | Testing for bacteria infection |
| Nucleic acid extraction reagent | Capitalbio Technology | SEDA 20160034 | For DNA extraction |
| RTisochip-W | Capitalbio Technology | SEDA 20193220539 | Loop-mediated Isothermal Amplification |
| THERMO ST16R | Thermo Fisher Scientific | SEDA 20180585 | Centrifuge the residual liquid off the wall of the tube. |
| Vortex mixer VM-5005 | JOANLAB | For mixing reagent |
References
- GBD 2016 Lower Respiratory Infections Collaborators. Estimates of the global, regional, and national morbidity, mortality, and aetiologies of lower respiratory infections in 195 countries, 1990-2016: A systematic analysis for the global burden of disease study 2016. Lancet Infect Dis. 18 (11), 1191-1210 (2018).
- Niederman, M. S., Torres, A. Respiratory infections. Eur Respir Rev. 31 (166), 220150 (2022).
- Weiser, J. N., Ferreira, D. M., Paton, J. C. Streptococcus pneumoniae: Transmission, colonization and invasion. Nat Rev Microbiol. 16 (6), 355-367 (2018).
- Watt, J. P., et al. Burden of disease caused by Haemophilus influenzae type b in children younger than 5 years_ global estimates. Lancet. 374 (9693), 903-911 (2009).
- Kadioglu, A., Weiser, J. N., Paton, J. C., Andrew, P. W. The role of streptococcus pneumoniae virulence factors in host respiratory colonization and disease. Nat Rev Microbiol. 6 (4), 288-301 (2008).
- Popova, G., Boskovska, K., Arnaudova-Danevska, I., Smilevska-Spasova, O., Jakovska, T. Sputum quality assessment regarding sputum culture for diagnosing lower respiratory tract infections in children. Open Access Maced J Med Sci. 7 (12), 1926-1930 (2019).
- Nuyttens, H., Cyncynatus, C., Renaudin, H., Pereyre, S., Identification Bébéar, C. expression and serological evaluation of the recombinant ATP synthase beta subunit of mycoplasma pneumoniae. BMC Microbiol. 10 (1), 216 (2010).
- Noviello, S., Huang, D. B. The basics and the advancements in diagnosis of bacterial lower respiratory tract infections. Diagnostics (Basel). 9 (2), 37 (2019).
- Hanson, K. E., et al. Molecular testing for acute respiratory tract infections: Clinical and diagnostic recommendations from the IDSA’s diagnostics committee. Clin Infect Dis. 71 (10), 2744-2751 (2020).
- Daniel Reynolds, J. P. B., et al. The threat of multidrug-resistant/extensively drug-resistant gram-negative respiratory infections: Another pandemic. Eur Respir Rev. 31 (166), 220068 (2022).
- T Notomi, H. O., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28 (12), 63 (2000).
- Soroka, M., Wasowicz, B., Rymaszewska, A. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): The better sibling of PCR. Cells. 10 (8), 1931 (2021).
- Mori, Y., Kitao, M., Tomita, N., Notomi, T. Real-time turbidimetry of lamp reaction for quantifying template DNA. Biophys J. 59 (2), 145-157 (2004).
- Parida, M., Sannarangaiah, S., Dash, P. K., Rao, P. V., Morita, K. Loop mediated isothermal amplification (LAMP): A new generation of innovative gene amplification technique: Perspectives in clinical diagnosis of infectious diseases. Rev Med Virol. 18 (6), 407-421 (2008).
- Chinese Medical Association Respiratory Branch Critical Care Medicine Group, Working Committee on Critical Care Medicine of the Chinese Physicians Association Respiratory Physicians Branch. Standardization of collection, submission, testing, and interpretation of bronchoalveolar lavage fluid in ICU patients. Chin J Tubere Respir Dis. 43 (9), 744-756 (2020).
- Koch, A. M., Nilsen, R. M., Eriksen, H. M., Cox, R. J., Harthug, S. Mortality related to hospital-associated infections in a tertiary hospital: Repeated cross-sectional studies between 2004-2011. Antimicrob Resist Infect Control. 4 (1), 57 (2015).
- Seymour, C. W. F. G., et al. Time to treatment and mortality during mandated emergency care for sepsis. N Engl J Med. 376 (23), 2235-2244 (2017).
- Choi, C. W., Hyun, J. W., Hwang, R. Y., Powell, C. A. Loop-mediated isothermal amplification assay for detection of candidatus Liberibacter asiaticus: A causal agent of citrus huanglongbing. Plant Pathol. 34 (6), 499-505 (2018).
- Büscher, P., Njiru, Z. K. Loop-mediated isothermal amplification technology: Towards point of care diagnostics. PLoS Negl Trop Dis. 6 (6), e1572 (2012).
- Notomi, T., Mori, Y., Tomita, N., Kanda, H. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): Principle, features, and future prospects. J Microbiol. 53 (1), 1-5 (2015).
- Ajibola, O., Gulumbe, B., Eze, A., Obishakin, E. Tools for detection of schistosomiasis in resource limited settings. Medical Sciences. 6 (2), 39 (2018).
- Kumar, Y. S. B., et al. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A rapid and sensitive tool for quality assessment of meat products. Compr Rev Food Sci Food SAF. 16 (6), 1359-1378 (2017).
- Hongling Ou, Y. W., et al. Rapid detection of multiple pathogens by the combined loop-mediated isothermal amplification technology and microfluidic chip technology. Ann Palliat Med. 10 (10), 11053-11066 (2021).
- Liang Wang, J. -. X. L., et al. Quantitative polymerase chain reaction (qPCR)-based rapid diagnosis of helicobacter pylori infection and antibiotic resistance. J Vis Exp. (197), e65689 (2023).
- Jing-Wen Lyu, B. X., et al. Rapid prediction of multidrug-resistant klebsiella pneumoniae through deep learning analysis of SERS spectra. Microbiol Spectr. 11 (2), e0412622 (2023).
- Wei Liu, J. -. W. T., et al. Discrimination between carbapenem-resistant and carbapenem-sensitive klebsiella pneumoniae strains through computational analysis of surface-enhanced Raman spectra a pilot study. Microbiol Spectr. 10 (1), e0240921 (2022).
- Zhang, L. Y., et al. Classification and prediction of klebsiella pneumoniae strains with different MLST allelic profiles via SERS spectral analysis. Peer J. 11, e16161 (2023).
- Zhi Liu, Q. Z., et al. Rapid and sensitive detection of salmonella in chickens using loop-mediated isothermal amplification combined with a lateral flow dipstick. J Microbiol Biotechnol. 29 (3), 454-464 (2019).
- Chen, F., et al. Fully Integrated microfluidic platform for multiplexed detection of hunov by a dynamic confined-space-implemented one-pot RPA-LAMP system. Adv Sci (Weinh). 21, e2306612 (2023).
