הערכה בזמן אמת של Ca2+ מוחלט, ציטוסולי, חופשי והתכווצות מקבילה בכלי לימפה מבודדים בלחץ
Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה למדוד בו זמנית סידן ציטוסולי, חופשי [Ca2+]i וקוטר כלי הדם בהתכווצות כלי הלימפה בזמן אמת ולאחר מכן לחשב ריכוזי Ca2+ מוחלטים וכן פרמטרים של התכווצות/ריתמוס. פרוטוקול זה יכול לשמש לחקר Ca2+ ודינמיקה של התכווצות במגוון תנאי ניסוי.
Abstract
כלי הדם הלימפטיים, המכונים כיום לעתים קרובות “מחזור הדם השלישי”, ממוקמים במערכות איברים חיוניות רבות. תפקיד מכני עיקרי של כלי הדם הלימפטיים הוא להחזיר נוזלים מחללים חוץ-תאיים בחזרה לצינורות הוורידים המרכזיים. הובלת הלימפה מתווכת על ידי התכווצויות קצובות ספונטניות של כלי הלימפה (LVs). התכווצויות LV מווסתות במידה רבה על ידי העלייה והירידה המחזוריות של סידן ציטוסולי, חופשי ([Ca2+]i).
מאמר זה מציג שיטה לחישוב בו-זמני של שינויים בריכוזים מוחלטים של [Ca2+]i והתכווצות/ריתמוס כלי הדם בזמן אמת ב-LVs מבודדים בלחץ. באמצעות LVs מזנטריים של חולדות מבודדות, חקרנו שינויים ב-[Ca2+]i והתכווצות/ריתמיות בתגובה להוספת תרופות. LVs מבודדים הועמסו במחוון חישת Ca2+ Fura-2AM, ומיקרוסקופ וידאו בשילוב עם תוכנת זיהוי קצה שימש כדי ללכוד [Ca2+]i ומדידות קוטר ברציפות בזמן אמת.
אות Fura-2AM מכל LV כויל לאות המינימלי והמקסימלי עבור כל כלי שיט ושימש לחישוב מוחלט [Ca2+]i. מדידות הקוטר שימשו לחישוב פרמטרים של התכווצות (משרעת, קוטר דיאסטולי סופי, קוטר סיסטולי סופי, זרימה מחושבת) וריתמיות (תדירות, זמן התכווצות, זמן הרפיה) וקורלציה עם מדידות מוחלטות [Ca2+]i .
Introduction
כלי הדם הלימפטיים נמצאים במערכות איברים רבות, כולל המוח, הלב, הריאות, הכליות והמזנטריה 1,2,3,4,5,6, ופועלים על ידי הנעת נוזל (לימפה) מהחללים הבין-תאיים אל צינורות הוורידים המרכזיים כדי לשמור על הומאוסטזיס נוזלים 7,8,9,10 . זה מתחיל עם נימי לימפה עיוורים בתוך מיטות נימי כלי הדם המתנקזים לכלי הלימפה הנאספים (LVs). איסוף LVs מורכב משתי שכבות של תאים: שכבה של תאי אנדותל המוקפת בשכבה של תאי שריר לימפה (LMCs)10,11. העברת נוזל הלימפה מושגת באמצעות כוחות חיצוניים (למשל היווצרות לימפה חדשה, פעימות עורקים, תנודות לחץ ורידי מרכזי) וכוחות פנימיים12.
הכוח הפנימי להובלת הלימפה הוא התכווצות קצבית ספונטנית של איסוף LVs, שהיא המוקד של רוב המחקרים הבוחנים את תפקוד הלימפה. משאבת לימפה פנימית זו מווסתת בעיקר על ידי העלייה והירידה המחזוריות של Ca2+ ([Ca2+]i). דפולריזציה ספונטנית של קרום הפלזמה ב- LMCs מפעילה ערוצי Ca2+ (Cav1.x) מגודרים במתח ומפעילה זרם Ca2+ והתכווצות קצבית LV 8,9,10. תפקיד זה הודגם על ידי חסימת Cav1.x עם חומרים ספציפיים, כמו nifedipine, אשר עיכב התכווצויות LV וגרם להרחבת כלי הדם13,14. העלייה הארעית ב[Ca2+]i או “Ca2+ ספייק” ב- LMCs בתיווך ערוצי Cav1.x עשויה גם להניע מאגרי Ca2+ תוך תאיים על ידי הפעלת קולטני אינוסיטול טריפוספט (IP3) וקולטני ריאנודין (RyRs) על הרשתית הסרקופלזמית (SR)15,16,17,18. הראיות הנוכחיות מצביעות על כך שקולטני IP3 תורמים יותר Ca2+ הנדרש להתכווצויות LV נורמליות בהשוואה ל- RyRs 15,16,19,20,21; עם זאת, RyRs עשוי לשחק תפקיד במהלך פתולוגיה או בתגובה להתערבות תרופתית 17,18. בנוסף, ההפעלה של תעלות K+ 22 המופעלות על ידי Ca2+ ותעלות אשלגן רגישות ל-ATP (KATP)23,24 יכולה לגרום להיפרפולציה של קרום LMC ולעכב פעילות התכווצות ספונטנית.
ישנן תעלות יונים וחלבונים רבים אחרים שעשויים לווסת את הדינמיקה של Ca2+ באיסוף LVs. שימוש בשיטות לחקר שינויים ב- Ca2+ והתכווצות כלי הדם בתגובה לסוכנים פרמקולוגיים בזמן אמת חשוב כדי להבין את הרגולטורים הפוטנציאליים הללו. שיטה מוקדמת יותר שהשתמשה בפורה-2 למדידת שינויים יחסיים ב-LV [Ca2+]i תוארה25. מכיוון שקבוע הדיסוציאציה עבור Fura-2 ו- Ca2+ ידוע26, ניתן לחשב ריכוזים בפועל של Ca2+, מה שמרחיב את היישום של שיטה זו ומספק תובנה נוספת לגבי איתות Ca2+ , רגישות הממברנה ומנגנוני ההתכווצות27, כמו גם מאפשר השוואה בסיסית בין קבוצות ניסוי. גישה אחרונה זו שימשה cardiomyocytes28, ולכן, ניתן להתאים LVs. מאמר זה מציג שיטה משופרת המשלבת את שתי הגישות הללו למדידה וחישוב של שינויים מוחלטים [Ca2+]i וכן התכווצות/ריתמוס כלי דם ברציפות בזמן אמת ב-LVs מבודדים בלחץ. אנו מספקים גם תוצאות מייצגות עבור LVs שטופלו בניפדיפין.
Protocol
Representative Results
Discussion
בשל אופיים השברירי והמזערי של LVs, הכרחי לנקוט בזהירות מרבית הן בתהליכי הדיסקציה והן בתהליכי הקנולציה. אפילו נזק קל לכלי יכול להוביל להתפתחות של LV שאינו בר קיימא או לגרום לחריגות ב [Ca2+]i transients. עקביות בהגדרות עירור חיונית באותה מידה לאורך כל סדרת הניסויים כדי להבטיח השוואה במדידות [Ca2+]i בין קבוצת הביקורת לקבוצות המטופלות. אי שמירה על הגדרות אחידות מהווה סיכון משמעותי להערכת יתר או חסר [Ca2+]i על פני כלי שיט בתוך סדרת ניסויים. באופן דומה, חשוב באותה מידה לזהות ולנטר במדויק את אותו אזור כלי דם לאורך כל ניסוי.
השימוש במחוון היחסימטרי Fura-2AM מנרמל שינויים פלואורסצנטיים הנגרמים על ידי עובי רקמה לא אחיד, פיזור/דליפה פלואורופורית או הלבנה, בעיות נפוצות בצבעים באורך גל יחיד. 31 הדבר מאפשר את הניטור הרציף המתואר בפרוטוקול זה. עם זאת, מכיוון ש- Fura-2 פועל על ידי כלאט Ca2+, ניתן להעמיס יתר על המידה את ה- LVs ולהפחית את [Ca2+]i הזמין להתכווצות או תגובה לתרופות. במקרים אלה, עדיין ניתן לראות קוצים Ca2+ בזמן שהתכווצויות קצובות נעדרות. גם אורך LV משתנה עשוי לתרום לתופעה זו. בעוד שמדידות Ca2+ אלה עשויות עדיין להיות תקפות, ייתכן שיהיה צורך להפחית את הריכוז של Fura-2AM בתצורות משוכפלות כדי להשיג בהצלחה הן מדידות Ca2+ והן מדידות קוטר. התוצאות שלנו כוללות רק LVs שעבורם היו גם קפיצות Ca2+ וגם התכווצויות קצובות בנקודת ההתחלה.
מדידת Rmin ו- Rmax הם שלבים קריטיים בחישוב מוחלט [Ca2+]i. מכיוון ש– R min צריך להיות יחס Fura-2 בהיעדר Ca2+, נוסף ריכוז גבוה של EGTA ל- PSS נטול Ca2+ כדי להבטיח את הקלציה של כל שארית Ca2+ . מחקרים ראשוניים נערכו עם EDTA ב- PSS נטול Ca2+, וזה הביא להתכווצויות כלי דם ספורדיות עם קוצים תואמים Ca2+ . עבור Rmax, ריכוז גבוה של Ca2+ נוסף ל-PSS יחד עם יונופור, יונומיצין, כדי למקסם את האות [Ca2+]i . הפתרון הגבוה Ca2+ עשוי לזרז, אשר עשוי לדרוש את הסרת EDTA מן PSS. חשוב לציין, מדידות נוספות אלה של Rmin ו- Rmax מספקות הזדמנות להעריך שינויים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית ב- [Ca2+]i, אשר יכולים לספק מידע על מנגנוני עוררות והתכווצות הממברנה27 וכן לאפשר השוואות בסיסיות בין קבוצות ניסוי בהשוואה לפרוטוקולים המדווחים רק על יחס 340/380 עבור Fura-2. כישלון בהשגת ערכי Rmin ו- Rmax מספיקים מונע את היכולת לחשב ערכים מוחלטים [Ca2+]i.
בשל האופי המתכווץ של ה- LVs, שיטה זו יכולה לספק רק מדד של רמות Ca2+ גלובליות ולא אירועי שחרור מקומיים של Ca2+ שניתן למדוד בכלי דם משותקים32. עם זאת, שיטה זו היא יתרון בקורלציה שינויים בדינמיקה מוחלטת [Ca2+]i עם התכווצות בהשוואה לשיטות המשתמשות בכלי דם משותקים או תאים בודדים28,32. עבור גישה זו, ההנחה היא שרוב Ca2+ שנמדד מקורו בתאי שריר הלימפה. עם זאת, תאי אנדותל, אשר נמצאים גם ב- LVs מבודדים אלה, עשויים לתרום לאות Ca2+ הכולל שנצפה33. ניתן להעריך תרומה זו באמצעות LVs שנשללו מאנדותל34. התכווצויות LV עשויות גם לגרום לדופן כלי הדם לזוז מעט פנימה והחוצה ממיקוד במהלך מחזור ההתכווצות. לכן, חשוב להשתמש בקטעי כלי קצרים שניתן למשוך מתוח אך מבלי למתוח את הכלי.
מעבר ליישומה ב-LVs, שיטה זו יכולה לשמש לחקר כלי דם מבודדים ממיטות כלי דם אחרות, כולל עורקים וורידים, והיא טומנת בחובה הבטחה לשימוש פוטנציאלי בנוירוביולוגיה ובענפים אחרים של ביולוגיה וסקולרית. חקירת ההשפעות של אגוניסטים או אנטגוניסטים שונים המכוונים למסלולי העברת אותות שונים היא דרך נוספת לחקור את הדינמיקה הבסיסית של Ca2+ . יתר על כן, טכניקה זו יכולה לשמש גם למחקר השוואתי הכולל דגימות בקרה וטיפול מבעלי חיים בהתאמה. יתר על כן, גישה זו ניתנת להתאמה ליישום ברמה התאית, כגון בתאי שריר לימפטיים מבודדים, הדורשים התאמות מינימליות לתא הזילוח ולמטרות המיקרוסקופ. לסיכום, שיטה זו מספקת תובנה רלוונטית פיזיולוגית לדינמיקה הגלובלית של Ca2+ מכיוון שהיא קשורה להתכווצות וריתמיות ב- LVs ומספקת הערכה חזקה של רגולטורים פוטנציאליים של דינמיקת Ca2+ באיסוף LVs.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות, כולל המכון הלאומי למדעי הרפואה הכלליים, המרכזים למצוינות במחקר ביו-רפואי (COBRE), המרכז לחקר תגובת מארח לטיפול בסרטן [P20-GM109005], המכון הלאומי לסרטן [1R37CA282349-01], ומלגת הקדם-דוקטורט של איגוד הלב האמריקאי [מספר פרס: 23PRE1020738; https://doi.org/10.58275/AHA.23PRE1020738.pc.gr.161089]. התוכן הוא באחריותם הבלעדית של המחברים ואינו מייצג בהכרח את הדעות הרשמיות של NIH או AHA. איור 1 ואיור 3 נוצרו עם BioRender.com.
Materials
| 20x S Fluor objective | Olympus Corporation of the Americas (Center Valley, PA, United States) | UPlanSApo | |
| Borosilicate glass micropipettes | Living Systems Instrumentation (Burlington, VT, United States) | GCP-75-100 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Fisher Bioreagents (Waltham, MA, United States) | BP510-500 | |
| Carbon dioxide (CO2) | nexAir (Memphis, TN, United States) | UN3156 | |
| Dissection forceps | Fine Science Tools (Foster City, CA, United States) | 11254-20 | |
| EDTA (C10H16N2O8) | Fisher Bioreagents (Waltham, MA, United States) | BP118-500 | |
| EGTA (C14H24N2O10) | Fisher Bioreagents (Waltham, MA, United States) | O2783-100 | |
| Fura-2AM | Invitrogen (Waltham, MA, United States) | F1221 | |
| Glucose (C6H12O6) | Fisher Bioreagents (Waltham, MA, United States) | D16-500 | |
| Gravity-Fed Pressure regulator | custom-made in the lab | ||
| Heating unit | Living Systems Instrumentation (Burlington, VT, United States) | TC-09S | |
| Imaging software | IonOptix (Westwood, MA, United States) | ||
| Inverted fluorescent microscope | Olympus Corporation of the Americas (Center Valley, PA, United States) | IX73 | |
| Ionomycin | Invitrogen (Waltham, MA, United States) | I24222 | |
| IonOptix Cell Framing Adaptor | IonOptix (Westwood, MA, United States) | 665 DXR | |
| Isoflurane | Piramal Critical Care (Telangana, India) | NDC 66794-017-10 | |
| Isolated vessel perfusion chamber | Living Systems Instrumentation (Burlington, VT, United States) | CH-1 | |
| Knot preparation forceps | Fine Science Tools (Foster City, CA, United States) | 11253-20 | |
| LED light source | Olympus Corporation of the Americas (Center Valley, PA, United States) | TL4 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Acros Organics (New Jersey, NJ, Unites States) | 213115000 | |
| MyoCam-S3 Fast CMOS video system | IonOptix (Westwood, MA, United States) | MCS300 | |
| Nifedipine | Sigma (St. Louis, MO, United States) | N7634 | |
| Ophthalmic sutures | |||
| Oxygen (O2) | nexAir (Memphis, TN, United States) | UN1072 | |
| Pluronic acid | Sigma (St. Louis, MO, United States) | P2443 | |
| Potassium chloride (KCl) | Fisher Bioreagents (Waltham, MA, United States | BP366-500 | |
| Pressure monitor system | Living Systems Instrumentation (Burlington, VT, United States) | PM-4 | |
| Pressure Transducer | Living Systems Instrumentation (Burlington, VT, United States) | PT-F | |
| Silicone-lined petri-dish | custom-made in the lab | ||
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Fisher Bioreagents (Waltham, MA, United States | BP328-500 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Bioreagents (Waltham, MA, United States | BP358-212 | |
| Sodium phosphate (NaH2PO4) | Fisher Bioreagents (Waltham, MA, United States | BP329-500 | |
| Sprague-Dawley rats | Envigo RMS (Indianapolis, IN, USA) | Male | 9-13 weeks old |
| Stereomicroscope | Leica Microsystems (Wetzlar, Germany) | S9D | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools (Foster City, CA, United States) | 15000-03 |
References
- Takahashi, T., Shibata, M., Kamiya, A. Mechanism of macromolecule concentration in collecting lymphatics in rat mesentery. Microvasc Res. 54 (3), 193-205 (1997).
- Ishikawa, Y., et al. The human renal lymphatics under normal and pathological conditions. Histopathology. 49 (3), 265-273 (2006).
- Fanous, M. Y. Z., Phillips, A. J., Windsor, J. A. Mesenteric lymph: the bridge to future management of critical illness. JOP. 8 (4), 374-399 (2007).
- El-Chemaly, S., Levine, S. J., Moss, J. Lymphatics in lung disease. Ann N Y Acad Sci. 1131 (1), 195-202 (2008).
- Klotz, L., et al. Cardiac lymphatics are heterogeneous in origin and respond to injury. Nature. 522 (7554), 62-67 (2015).
- Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
- Aukland, K., Reed, R. K. Interstitial-lymphatic mechanisms in the control of extracellular fluid volume. Physiol Rev. 73 (1), 1-78 (1993).
- Zawieja, D. C. Contractile physiology of lymphatics. Lymphat Res Biol. 7 (2), 87-96 (2009).
- Nipper, M. E., Dixon, J. B. Engineering the Lymphatic System. Cardiovasc Eng Technol. 2 (4), 296-308 (2011).
- Choi, I., Lee, S., Hong, Y. K. The new era of the lymphatic system: No longer secondary to the blood vascular system. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (4), 006445 (2012).
- Ji, R. C. Lymphatic endothelial cells, lymphedematous lymphangiogenesis, and molecular control of edema formation. Lymphat Res Biol. 6 (3-4), 123-137 (2008).
- Scallan, J. P., Zawieja, S. D., Castorena-Gonzalez, J. A., Davis, M. J. Lymphatic pumping: mechanics, mechanisms and malfunction. J Physiol. 594 (20), 5749-5768 (2016).
- Lee, S., Roizes, S., vonder Weid, P. Y. Distinct roles of L- and T-type voltage-dependent Ca2+ channels in regulation of lymphatic vessel contractile activity. J Physiol. 592 (24), 5409-5427 (2014).
- Telinius, N., et al. Human lymphatic vessel contractile activity is inhibited in vitro but not in vivo by the calcium channel blocker nifedipine. J Physiol. 592 (21), 4697-4714 (2014).
- Imtiaz, M. S., Zhao, J., Hosaka, K., vonder Weid, P. Y., Crowe, M., van Helden, D. F. Pacemaking through Ca2+ stores interacting as coupled oscillators via membrane depolarization. Biophys J. 92 (11), 3843-3861 (2007).
- Jo, M., Trujillo, A. N., Yang, Y., Breslin, J. W. Evidence of functional ryanodine receptors in rat mesenteric collecting lymphatic vessels. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 317 (3), H561-H574 (2019).
- Stolarz, A. J., et al. Doxorubicin Activates Ryanodine Receptors in Rat Lymphatic Muscle Cells to Attenuate Rhythmic Contractions and Lymph Flow. J Pharmacol Exp Ther. 371 (2), 278-289 (2019).
- Van, S., et al. Dantrolene Prevents the Lymphostasis Caused by Doxorubicin in the Rat Mesenteric Circulation. Front Pharmacol. 12, 727526 (2021).
- Atchison, D. J., Johnston, M. G. Role of extra- and intracellular Ca2+ in the lymphatic myogenic response. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 272 (1), R326-R333 (1997).
- Atchison, D. J., Rodela, H., Johnston, M. G. Intracellular calcium stores modulation in lymph vessels depends on wall stretch. Can J Physiol Pharmacol. 76 (4), 367-372 (1998).
- Zhao, J., van Helden, D. F. ET-1-associated vasomotion and vasospasm in lymphatic vessels of the guinea-pig mesentery. Br J Pharmacol. 140 (8), 1399-1413 (2003).
- Cotton, K. D., Hollywood, M. A., McHale, N. G., Thornbury, K. D. Outward currents in smooth muscle cells isolated from sheep mesenteric lymphatics. J Physiol. 503 (1), 1-11 (1997).
- Mathias, R., vonder Weid, P. Y. Involvement of the NO-cGMP-KATP channel pathway in the mesenteric lymphatic pump dysfunction observed in the guinea pig model of TNBS-induced ileitis. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 304 (6), G623-G634 (2013).
- Garner, B. R., et al. KATP channel openers inhibit lymphatic contractions and lymph flow as a possible mechanism of peripheral edema. J Pharmacol Exp Ther. 376 (1), 40-50 (2021).
- Souza-Smith, F. M., Kurtz, K. M., Breslin, J. W. Measurement of cytosolic Ca2+ in isolated contractile lymphatics. J Vis Exp. (58), e3438 (2011).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem. 260 (6), 3440-3450 (1985).
- Hill-Eubanks, D. C., Werner, M. E., Heppner, T. J., Nelson, M. T. Calcium signaling in smooth muscle. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (9), 1-20 (2011).
- Harmer, A. R., Abi-Gerges, N., Morton, M. J., Pullen, G. F., Valentin, J. P., Pollard, C. E. Validation of an in vitro contractility assay using canine ventricular myocytes. Toxicol Appl Pharmacol. 260 (2), 162-172 (2012).
- IonOptix LLC. . IonWizard 7.2 Acquisition. , (2017).
- IonOptix LLC. IonWizard 7.2 Core & Analysis Functions. IonOptix LLC. , (2017).
- Roe, M. W., Lemasters, J. J., Herman, B. Assessment of Fura-2 for measurements of cytosolic free calcium. Cell Calcium. 11 (2-3), 63-73 (1990).
- Zawieja, S. D., et al. Ano1 mediates pressure-sensitive contraction frequency changes in mouse lymphatic collecting vessels. J Gen Physiol. 151 (4), 532-554 (2019).
- Behringer, E. J., et al. Calcium and electrical dynamics in lymphatic endothelium. J Physiol. 595 (24), 7347-7368 (2017).
- Ferrusi, I., Zhao, J., van Helden, D., vonder Weid, P. Y. Cyclopiazonic acid decreases spontaneous transient depolarizations in guinea pig mesenteric lymphatic vessels in endothelium-dependent and -independent manners. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (6), H2287-H2295 (2004).
