HEK293 부유 세포를 사용한 고수율 Adeno 관련 벡터 배치 생산
Summary
여기에서 현탁액 HEK293 셀 기반 AAV 생산 프로토콜이 제시되어 상용 공급업체에서 연구 목적으로 사용할 수 있는 구성 요소를 사용하여 벡터 생산에 필요한 시간과 노동력을 줄일 수 있습니다.
Abstract
아데노 관련 바이러스 벡터(AAV)는 중추신경계(CNS)를 조사하기 위한 놀라운 도구입니다. AAV와 같은 혁신적인 캡시드. PHP.eB, 생쥐에 정맥 주사를 통한 CNS의 광범위한 transduction을 보여줍니다. 비교 가능한 형질도입을 달성하려면 중추신경계 실질에 직접 주입하는 것과 비교하여 100배 더 높은 역가(최소 1 x 1011 게놈 복제/마우스)가 필요합니다. 우리 그룹에서는 AAV를 포함한 AAV 생산. PHP.eB는 부착 HEK293T 세포와 삼중 형질 주입 방법에 의존합니다. 부착 세포로 높은 AAV 수율을 달성하려면 노동 및 재료 집약적인 공정이 수반됩니다. 이러한 제약은 원뿔형 튜브에서 현탁 기반 세포 배양을 위한 프로토콜의 개발을 촉진했습니다. 부착 세포에서 생성된 AAV를 현탁액 생산 방법과 비교했습니다. 형질주입 시약인 폴리에틸렌이민 또는 TransIt을 이용한 현탁액에서의 배양을 비교하였다. AAV 벡터는 요오딕사놀 그래디언트 초원심분리에 의해 정제된 후 원심 필터를 사용하여 완충액 교환 및 농축에 의해 정제되었습니다. 부착 방법을 사용하면 평균 2.6 x 1012 게놈 사본(GC)을 얻을 수 있는 반면, 현탁법과 폴리에틸렌이민은 총 7.7 x 1012 GC를, TransIt은 총 2.4 x 1013 GC를 산출했습니다. 부유세포 시스템과 비교하여 부착체로 생산된 벡터 간의 in vivo transduction 효율에는 차이가 없습니다. 요약하면, 현탁액 HEK293 셀 기반 AAV 생산 프로토콜이 도입되어 벡터 생산에 필요한 시간과 노동력을 줄이는 동시에 연구 목적으로 상용 공급업체에서 제공하는 구성 요소를 사용하여 3배에서 9배 더 높은 수율을 달성할 수 있습니다.
Introduction
아데노 관련 바이러스(AAV)는 1965년에 발견되었으며 이후 수많은 응용 분야에서 사용되고 있습니다1. AAV는 유전자 및 신경 기능을 연구하거나, 신경 회로를 매핑하거나, 질병에 대한 동물 모델을 생성하기 위해 신경 과학 연구에 적용되었습니다2. 전통적으로, 이것은 대부분의 자연적인 혈청형이 혈액 뇌 장벽을 통과하지 않거나 그렇게 하기 위하여 과다 복용을 필요로 하지 않기 때문에, 관심사의 위치에 직접 주사해서 행해집니다 1,2,3.
AAV의 발견과 함께. PHP.B4 및 AAV와 같은 차세대 캡시드. PHP.eB5 및 AAV. CAP-B106의 경우, 간단한 전신 주사를 사용하여 중추신경계(CNS)를 표적으로 할 수 있습니다. 공간 매핑은 AAV의 표적이 되는 세포를 보여줍니다. 셀룰러 수준 6,7의 PHP.eB. 특정 프로모터/인핸서와 함께 이러한 캡시드는 신경과학자들이 비침습적 AAV 전달을 통해 유전자 및 뇌 기능을 연구할 수 있는 광범위한 기회를 제공합니다 4,8.
AAV에는 더 낮은 용량이 필요합니다. AAV9 (4 x 1012 GC/mouse)7에 비해 PHP.eB(일반적으로 1 – 5 x 1011 게놈 사본(GC)/mouse)는 직접 주입 전략(일반적으로 1 x 109 GC/μL 주입)에 비해 더 많은 벡터를 생성해야 합니다. 대부분의 천연 혈청형은 요오드릭산올 정제 9,10,11,12와 함께 고전적인 부착 세포 배양 시스템을 사용하여 생산할 수 있습니다. AAV의 경우. PHP.eB 이것은 하나의 실험에 충분한 벡터를 얻기 위해 세포를 배양하고 transfection하는 노동 집약적인 과정을 수반한다8. 따라서, 원뿔형 튜브의 부유 세포 배양에서 AAV의 생산이 개발되었습니다. 최대 300mL 용량의 코니컬 튜브는 크기가 작아 인큐베이터 공간과 플라스틱을 모두 절약할 수 있습니다. 부유 세포는 15cm 플레이트의 부착 세포보다 배양 및 대량으로 처리하기가 훨씬 쉽습니다. 프로토콜의 transfection 구성 요소는 동일하게 유지됩니다. 따라서, 이전에 부착 시스템과 함께 사용되었던 플라스미드는 현탁 세포에서의 생산에 기초하여 이 프로토콜에서 쉽게 사용될 수 있습니다. 이 프로토콜은 실험실의 다른 연구원들에게 성공적으로 이전되어 다양한 캡시드 및 구조물에 성공적으로 사용되었습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
AAV의 전신 투여는 중추신경계로의 유전자 전달을 위한 강력한 도구입니다. 그러나 AAV의 생산은 비용이 많이 들고 힘든 과정입니다. 부유 셀을 사용하면 15cm2 플레이트에 HEK293T 부착 배양에 비해 노동력과 플라스틱이 줄어 듭니다. 또한 여기에 구현된 원뿔형 튜브는 다루기 쉽고 실험실 공간 사용을 극대화합니다. 이 프로토콜은 두 명의 연구원에 의해 설정되었으며 이후 실험실의 다른 사?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 네덜란드 왕립 예술 과학 아카데미(KNAW) 연구 기금과 Start2Cure(0-TI-01)의 보조금으로 지원되었습니다. 프로토콜 설정에 대한 의견과 조언을 해주신 Leisha Kopp에게 감사드립니다. 피규어는 Biorender를 사용하여 생성되었습니다.
Materials
| 39 mL, Quick-Seal Round-Top Polypropylene Tube, 25 x 89 mm – 50Pk | Beckman Coulter | 342414 | |
| Adapter 600 mL conical tubes, for rotor S-4×1000, | eppendorf | 5920701002 | |
| Adapter Plate fits 16 bioreactors of 600 ml | Infors HT/ TPP | 587633 | |
| Aerosol-tight caps, for 750 mL round buckets | eppendorf | 5820747005 | |
| Centrifuge 5920 R G, 230 V, 50-60 Hz, incl. rotor S-4×1000, round buckets and adapter 15 mL/50 mL conical tubes | eppendorf | 5948000315 | |
| Distilled Water | Gibco | 15230147 | |
| DNase I recombinant, RNase-free | Roche | 4716728001 | |
| DNase I recombinant, RNase-free | Roche | 4716728001 | |
| DPBS, calcium, magnesium | Gibco | 14040091 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | |
| Fisherbrand Disposable PES Filter Units 0,2 | Fisher | FB12566504 | |
| Fisherbrand Disposable PES Filter Units 0,45 | Fisher | FB12566505 | |
| Holder for 50 ml culture tubes also fits falcon tube | Infors HT/ TPP | 31362 | |
| Holder for 600 ml cell culture tube | Infors HT/ TPP | 66129 | |
| Incubator Minitron 50 mm | Infors HT | 500043 | |
| LV-MAX Production Medium | Gibco | A3583401 | |
| N-Tray Universal | Infors HT/ TPP | 31321 | |
| OptiPrep – Iodixanol | Serumwerk bernburg | 1893 | |
| PEI MAX – Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000) | Poly-sciences | 24765-100 | |
| Phenol red solution | Sigma-Aldrich | 72420100 | |
| Poly(ethylene glycol) 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
| TransIT-VirusGEN | Mirus | Mir 6706 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 5250061 | |
| TubeSpin Bioreactors-50ml | TTP | 87050 | |
| TubeSpin Bioreactors-600ml | TTP | 87600 | |
| Viral Production Cells | Gibco | A35347 | |
| Vivaspin 20 MWCO 100 000 | Cytvia | 28932363 |
References
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