Summary

Produção de lotes vetoriais associados a adeno de alto rendimento usando células de suspensão HEK293

Published: April 26, 2024
doi:

Summary

Aqui, um protocolo de produção de AAV baseado em células HEK293 de suspensão é apresentado, resultando em tempo e mão de obra reduzidos necessários para a produção de vetores usando componentes que estão disponíveis para fins de pesquisa de fornecedores comerciais.

Abstract

Os vetores virais adenoassociados (AAVs) são uma ferramenta notável para a investigação do sistema nervoso central (SNC). Capsídeos inovadores, como o AAV. PHP.eB, demonstram extensa transdução do SNC por injeção intravenosa em camundongos. Para obter transdução comparável, um título 100 vezes maior (minimamente 1 x10 11 cópias do genoma/camundongo) é necessário em comparação com a injeção direta no parênquima do SNC. Em nosso grupo, a produção de AAV, incluindo AAV. O PHP.eB baseia-se em células HEK293T aderentes e no método de tripla transfecção. Alcançar altos rendimentos de AAV com células aderentes envolve um processo trabalhoso e intensivo em material. Essa restrição motivou o desenvolvimento de um protocolo para cultura de células em suspensão em tubos cônicos. Os AAVs gerados em células aderentes foram comparados com o método de produção em suspensão. Foram comparadas culturas em suspensão utilizando os reagentes de transfecção Polietilenimina ou TransIt. Os vetores AAV foram purificados por ultracentrifugação com gradiente de iodixanol seguido de troca e concentração de tampão com filtro centrífugo. Com o método aderente, obteve-se uma média de 2,6 x 1012 cópias do genoma (CG) no total, enquanto o método de suspensão e Polietilenimina produziram 7,7 x10 12 GC no total, e TransIt produziu 2,4 x 1013 GC no total. Não há diferença na eficiência de transdução in vivo entre vetores produzidos com aderência em relação ao sistema de células de suspensão. Em resumo, um protocolo de produção AAV baseado em células HEK293 de suspensão é introduzido, resultando em uma quantidade reduzida de tempo e mão de obra necessária para a produção de vetores, enquanto alcança rendimentos 3 a 9 vezes maiores usando componentes disponíveis de fornecedores comerciais para fins de pesquisa.

Introduction

O vírus adenoassociado (AAV) foi descoberto em 1965 e, desde então, tem sido usado em uma infinidade deaplicações1. Os AAVs têm sido aplicados em pesquisas em neurociência para estudar genes e funções neuronais, mapear neurocircuitos ou produzir modelos animais para doenças2. Tradicionalmente, isso é feito injetando-se diretamente no local de interesse, pois a maioria dos sorotipos naturais não atravessa a barreira hematoencefálica ou necessita de uma dose alta para fazê-lo 1,2,3.

Com a descoberta da AAV. PHP.B4 e capsídeos de próxima geração, como AAV. PHP.eB5 e AAV. CAP-B106, é possível atingir o sistema nervoso central (SNC) com uma simples injeção sistêmica. O mapeamento espacial revela as células alvo do AAV. PHP.eB a nível celular 6,7. Em combinação com promotores/potencializadores específicos, esses capsídeos oferecem amplas oportunidades para neurocientistas estudarem genes e função cerebral por meio da liberação não invasiva de AAV 4,8.

Enquanto uma dose mais baixa é necessária para AAV. PHP.eB (tipicamente 1 a 5 x 1011 Cópias do Genoma (GC)/rato) em comparação com AAV9 (4 x10 12 GC/rato)7, ainda é necessário produzir mais vetor em comparação com as estratégias de injeção direta (tipicamente 1 x 109 GC/μL injecção). A maioria dos sorotipos naturais pode ser produzida utilizando o sistema clássico de cultura celular aderente em combinação com a purificação do iodixanol 9,10,11,12. Para AAV. PHP.eB isso implica um processo trabalhoso para cultivar e transfectar células para obter vetores suficientes para um experimento8. Portanto, desenvolveu-se a produção de AAV em cultura de células de suspensão em tubos cônicos. Os tubos cônicos, com capacidade de até 300 mL, são compactos, economizando espaço na incubadora e plásticos. As células de suspensão são muito mais fáceis de cultivar e manusear em grandes quantidades do que as células aderentes em placas de 15 cm. Os componentes de transfecção do protocolo permanecem os mesmos. Portanto, plasmídeos previamente utilizados com o sistema aderente podem ser facilmente utilizados neste protocolo baseado na produção em células de suspensão. O protocolo foi transferido com sucesso para outros pesquisadores no laboratório e usado com sucesso para vários capsídeos e construtos.

Protocol

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo comitê institucional de cuidados e uso de animais da Royal Netherlands Academy of Sciences (KNAW) e estavam de acordo com a Lei Holandesa de Experimentação Animal sob o projeto número AVD8010020199126. Na Figura 1, uma visão geral esquemática do protocolo completo é fornecida. Da semeadura das células à purificação do AAV, o protocolo leva 6 dias para ser concluído. 1. Preparação dos rea…

Representative Results

A maioria dos laboratórios acadêmicos utiliza células HEK293T aderentes para a produção de AAV 8,9. Embora isso funcione relativamente bem quando pequenas quantidades de AAV são necessárias para injeção direta, um título 100 vezes maior (minimamente 1 x 1011 GC/mouse) é necessário para obter transdução semelhante com capsídeos sistêmicos, como AAV. PHP.eB. Nesse protocolo, foi estabelecida a produção de AAV…

Discussion

A administração sistêmica de AAV é uma poderosa ferramenta para a transferência gênica para o SNC; no entanto, a produção de AAV é um processo caro e trabalhoso. Com o uso de células de suspensão, a mão de obra e os plásticos são reduzidos em comparação com a cultura aderente de HEK293T em placas de 15cm2 . Além disso, os tubos cônicos implementados aqui são fáceis de manusear e maximizam o uso do espaço do laboratório. O protocolo foi montado por dois pesquisadores e, posteriormente, apl…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado por uma bolsa do fundo de pesquisa da Academia Real de Artes e Ciências dos Países Baixos (KNAW) e uma bolsa da Start2Cure (0-TI-01). Agradecemos a Leisha Kopp por sua contribuição e conselhos na configuração do protocolo. As figuras foram criadas usando Biorender.

Materials

39 mL, Quick-Seal Round-Top Polypropylene Tube, 25 x 89 mm – 50Pk Beckman Coulter 342414
Adapter 600 mL conical tubes, for rotor S-4×1000,  eppendorf 5920701002
Adapter Plate fits 16 bioreactors of 600 ml Infors HT/ TPP 587633
Aerosol-tight caps, for 750 mL round buckets eppendorf 5820747005
Centrifuge 5920 R G, 230 V, 50-60 Hz, incl. rotor S-4×1000, round buckets and adapter 15 mL/50 mL conical tubes eppendorf 5948000315
Distilled Water Gibco 15230147
DNase I recombinant, RNase-free Roche 4716728001
DNase I recombinant, RNase-free Roche 4716728001
DPBS, calcium, magnesium Gibco 14040091
DPBS, no calcium, no magnesium Gibco 14190144
Fisherbrand Disposable PES Filter Units 0,2 Fisher FB12566504
Fisherbrand Disposable PES Filter Units 0,45 Fisher FB12566505
Holder for 50 ml culture tubes also fits falcon tube Infors HT/ TPP 31362
Holder for 600 ml cell culture tube Infors HT/ TPP 66129
Incubator Minitron 50 mm Infors HT 500043
LV-MAX Production Medium Gibco A3583401
N-Tray Universal Infors HT/ TPP 31321
OptiPrep – Iodixanol Serumwerk bernburg 1893
PEI MAX – Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000) Poly-sciences 24765-100
Phenol red solution  Sigma-Aldrich 72420100
Poly(ethylene glycol) 8000 Sigma-Aldrich 89510
TransIT-VirusGEN Mirus Mir 6706
Trypan Blue Solution, 0.4% Gibco 5250061
TubeSpin Bioreactors-50ml TTP 87050
TubeSpin Bioreactors-600ml TTP 87600
Viral Production Cells Gibco A35347
Vivaspin 20 MWCO 100 000 Cytvia 28932363

References

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Cite This Article
Pietersz, K. L., Nijhuis, P. J., Klunder, M. H., van den Herik, J., Hobo, B., de Winter, F., Verhaagen, J. Production of High-Yield Adeno Associated Vector Batches Using HEK293 Suspension Cells. J. Vis. Exp. (206), e66532, doi:10.3791/66532 (2024).

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