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Biology

Detecção e Isolamento de Campylobacter spp.

Published: February 23, 2024
doi:
10.3791/66462
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1Characterization and Interventions for Foodborne Pathogens Research Unit, Eastern Regional Research Center,Agricultural Research Service (ARS), United States Department of Agriculture (USDA)

Summary

Campylobacter é a principal causa de gastroenterite bacteriana transmitida por alimentos em todo o mundo. Apesar de os estabelecimentos adotarem medidas para reduzir a prevalência em todas as suas instalações, os produtos contaminados chegam consistentemente aos consumidores. A técnica desenvolvida nos últimos doze anos aborda as limitações dos métodos existentes para isolar e detectar Campylobacter spp.

Abstract

Este artigo apresenta um protocolo rápido e robusto para isolar Campylobacter spp de carnes cruas, enfocando especificamente Campylobacter jejuni e Campylobacter coli. O protocolo se baseia em métodos estabelecidos, garantindo a compatibilidade com as técnicas predominantes empregadas por órgãos reguladores como a Food and Drug Administration (FDA) e o Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (USDA) nos EUA, bem como a International Organization for Standardization (ISO) na Europa. O ponto central deste protocolo é a coleta de um enxágue, que é concentrado e ressuspendido em meio de caldo de Bolton contendo sangue de cavalo. Este meio provou facilitar a recuperação de células de Campylobacter estressadas e reduzir a duração de enriquecimento necessária em 50%. As amostras enriquecidas são então transferidas para membranas de nitrocelulose em placas de brucela. Para melhorar a sensibilidade e a especificidade do método, membranas filtrantes de 0,45 μm e 0,65 μm foram avaliadas. Os dados revelaram um aumento de 29 vezes na recuperação celular com o filtro de tamanho de poro de 0,65 μm em comparação com o tamanho de poro de 0,45 μm, sem afetar a especificidade. As características altamente móveis de Campylobacter permitem que as células se movam ativamente através dos filtros de membrana em direção ao meio ágar, o que permite o isolamento eficaz de colônias puras de Campylobacter . O protocolo incorpora ensaio quantitativo multiplex de reação em cadeia da polimerase em tempo real (mqPCR) para identificar os isolados em nível de espécie. Esta técnica molecular oferece um meio confiável e eficiente de identificação de espécies. Investigações realizadas nos últimos doze anos envolvendo carnes de varejo demonstraram a capacidade deste método para melhorar a recuperação de Campylobacter a partir de amostras de carne naturalmente contaminadas em comparação com os métodos de referência atuais. Além disso, este protocolo possui tempo reduzido de preparação e processamento. Como resultado, apresenta-se como uma alternativa promissora para a recuperação eficiente de Campylobacter da carne. Além disso, esse procedimento pode ser perfeitamente integrado a métodos baseados em DNA, facilitando a triagem rápida de amostras positivas juntamente com uma análise abrangente de sequenciamento do genoma inteiro.

Introduction

são a principal causa de gastroenterite bacteriana transmitida por alimentos no mundo, com estimativa de 800 milhões de casos anuais1. Como uma das principais bactérias zoonóticas, Campylobacter coloniza naturalmente o trato gastrointestinal de uma ampla gama de animais, incluindo aves selvagens, animais de fazenda e animais de estimação2. Durante o abate ou processamento de alimentos, Campylobacter spp contamina frequentemente carcaças ou produtos cárneos3. A campilobacteriose geralmente está associada ao consumo de aves mal cozidas ou à contaminação cruzada de outros alimentos por sucos crus de aves2. Pode causar complicações graves, como síndrome de Guillain-Barré, artrite reativa e septicemia em indivíduos imunocomprometidos4. Detectar e isolar Campylobacter de fontes alimentares, especialmente produtos avícolas, é essencial para a vigilância em saúde pública, investigação de surtos e avaliação de risco.

Os métodos convencionais baseados em cultura são os métodos tradicionais e padronizados para detecção de Campylobacter5,6. No entanto, existem várias limitações, incluindo longos tempos de incubação (48 h ou mais), baixa sensibilidade (até 50%) e não são inclusivas para todas as cepas (algumas células de Campylobacter estressadas podem não crescer bem ou de forma alguma no meio)7. Métodos moleculares, como a reação em cadeia da polimerase (PCR), são mais rápidos e sensíveis do que os métodos baseados em cultura, mas não fornecem isolados viáveis para caracterização posterior8,9.

Métodos imunológicos são métodos alternativos e complementares para a detecção de Campylobacter . Estes são rápidos, simples e versáteis, mas também têm várias limitações, incluindo reatividade cruzada (alguns anticorpos podem se ligar a bactérias não-Campylobacter ou outras substâncias que compartilham antígenos semelhantes), baixa especificidade (alguns anticorpos podem não se ligar a todas as cepas ou sorotipos de Campylobacter ) e requisitos de preparação da amostra (métodos imunológicos geralmente exigem pré-tratamento das amostras para remover substâncias interferentes para aumentar a ligação dos anticorpos)10.

Dentro do gênero Campylobacter, C. jejuni e C. coli causam a maioria das infecções humanas por Campylobacter (81% e 8,4%, respectivamente)11. Ambas são bactérias espirais, microaerofílicas e termofílicas contendo um flagelo unipolar ou flagelo bipolar. A rotação de um flagelo em cada polo é considerada a principal força motriz para sua motilidade característica do saca-rolhas e crucial para sua patogênese, pois permite que a bactéria nade através da mucosa viscosa do trato gastrointestinal do hospedeiro. A motilidade do Campylobacter é controlada pelo seu sistema quimiossensorial que permite que as células se movam em direção a ambientes favoráveis12,13. Com base na morfologia celular e nas características fisiológicas de Campylobacter, poucos estudos têm utilizado a filtração por membrana para o isolamento de Campylobacter spp., a partir de amostras fecais e ambientais14,15,16.

Este estudo apresenta um protocolo rápido e robusto para o isolamento e posterior detecção de C. jejuni e C. coli a partir de carne crua, que supera as desvantagens dos métodos existentes e oferece diversas vantagens. Colônias tentativas podem ser confirmadas como Campylobacter spp., usando uma variedade de métodos, como microscopia, testes bioquímicos (por exemplo, ensaios de atividade de catalase e oxidase) ou métodos moleculares6. O método identifica os isolados em nível de espécie usando um ensaio multiplex de PCR em tempo real (mqPCR) que tem como alvo genes exclusivos de C. jejuni e C. coli. Este método é relativamente barato, rápido e seletivo, o que o torna adequado para uso em uma variedade de ambientes, incluindo instalações de processamento de alimentos, laboratórios clínicos e laboratórios de pesquisa.

Protocol

Todo o trabalho associado a este protocolo deve ser conduzido dentro de um gabinete de segurança biológica (BSC) para manter as condições assépticas e minimizar o risco de contaminação da amostra ou exposição do operador a patógenos microbianos. Ao transferir amostras para fora do BSC, utilize recipientes lacrados para evitar derramamento em caso de quedas acidentais, mantendo a integridade da amostra. Preferencialmente, componentes descartáveis devem ser utilizados durante todo o procedimento para mitigar a possibilidade de contaminação cruzada. Nos casos em que os descartáveis não forem viáveis, certifique-se de que todos os equipamentos e materiais estejam estéreis antes do uso. A gestão adequada dos resíduos é crucial; Todos os componentes descartáveis usados devem ser descartados como resíduos de risco biológico. Autoclave os materiais antes do descarte para garantir a esterilização adequada e evitar a contenção de materiais potencialmente perigosos. A adesão a essas precauções não apenas protege a integridade da amostra, mas também minimiza o risco de exposição do operador a patógenos microbianos. A Figura 1 mostra o fluxo de trabalho de preparação de amostras, enriquecimento seletivo, isolamento baseado em filtro e diferenciação por mqPCR de espécies de Campylobacter . O Arquivo Suplementar 1 mostra um fluxo de trabalho e imagens mais detalhados durante todo o processo. 1. Preparação de amostras de carne Aquisição de amostras de carneAdquira vários pacotes de carne fresca, incluindo coxas de frango, asas, coxas e fígados de varejistas locais. Transfira todas as amostras para armazenamento a 4 °C e processe dentro de 24 h após o recebimento.NOTA: Armazenar as amostras frescas em temperaturas mais baixas, como abaixo de congelamento, afetará a recuperação. Processamento de amostras de carneSeguir a proporção de componentes prescritos na diretriz de amostragem FSIS 6,17. Corte 450 g de pedaços de frango de cada embalagem e coloque-os num saco de barriga de estômago (ver Tabela de Materiais).NOTA: Os sacos estomacais, são sugeridos porque têm resistência mecânica suficiente para garantir os processos a jusante e não se rompem ou vazam. Preparar água peptonada tamponada (BPW).Dissolver 20 g do pó (ver Tabela de Materiais) em 1 L de água purificada. Autoclave a solução a 121 °C durante 15 min. Diluir a solução em água estéril até uma concentração de 0,1%. Adicionar 200 mL de BPW a 0,1% ao saco do estômago contendo o frango. Massagear/palpar manualmente a amostra do lado de fora da bolsa do estômago por 2 min. Recolha todo o enxágue de frango do lado filtrado do saco utilizando um controlador de pipeta motorizado (ver Tabela de Materiais). Distribua o enxágue de frango em frascos de centrífuga estéreis. Centrifugar a 10.000 x g por 10 min à temperatura ambiente. Coletar cuidadosamente o sobrenadante usando um controlador de pipeta motorizado com uma pipeta de plástico sorológico descartável de 25 mL. Evite perturbar o pellet. Repita o processo conforme necessário para garantir que todo o sobrenadante seja removido. Descarte o sobrenadante coletado. 2. Enriquecimento seletivo de Campylobacter a partir de carne crua Preparação de Caldo Bolton com suplementosDissolver 13,8 g de pó (ver Tabela de Materiais) em 500 ml de água purificada. Esterilizar o caldo em autoclave por 15 min a 121 °C. Adicionar 25 ml de sangue de cavalo lacustre (ver Tabela de Materiais) ao caldo Bolton esterilizado de 500 ml.NOTA: A adição de sangue de cavalo atua como um agente de supressão de oxigênio para ajudar na recuperação de células de Campylobacter lesionadas da matriz alimentar. Reconstituir 1 frasco para injetáveis de suplemento antibiótico (cefoperazona, cicloheximida, trimetoprima e vancomicina, ver Tabela de Materiais) em 5 ml de etanol a 50%. Adicione o suplemento antibiótico reconstituído ao caldo Bolton. Procedimento de enriquecimentoRessuspender o pellet em 50 mL de Bolton Broth contendo sangue de cavalo e antibióticos. Coloque as amostras (com tampas soltas) dentro de um recipiente selado que mantenha uma mistura de gases de 85% N2, 10% CO2 e 5% O2.Certifique-se de que a tampa está solta, mas o recipiente está bem fechado para produzir os requisitos de crescimento microaerofílico e termofílico de Campylobacter.NOTA: Pacotes de gás que mantêm uma atmosfera de 85% N2, 10% CO2 e 5% O2 podem ser usados quando as câmaras ambientais não estão disponíveis. Incubar as amostras a 42 °C durante 24 horas. 3. Isolamento e purificação de C. jejuni e C. coli de frango cru Preparo de placas de ágar BrucellaDissolver 28 g de Brucella em pó (ver Tabela de Materiais) em 1 L de água purificada. Dissolver 15 g de ágar na solução de Brucella. Esterilizar o ágar Brucella em autoclave por 15 min a 121 °C. Arrefecer a mistura de ágar médio em banho-maria a 55 °C. Despeje 20 mL de ágar Brucella em cada placa de Petri de 100 mm de diâmetro. Método de filtragem e cultivo de colôniasAvaliar o efeito da umidade na passagem de Campylobacter pelos filtros por meio da secagem de placas de ágar Brucella com tampas abertas em gabinete de Biossegurança por 0 h, 1 h, 2 h e 3 h. Preparar um controlo sem filtro espalhando directamente 80 μL da amostra na placa de ágar Brucella. Coloque um filtro de acetato de celulose (0,45 μm ou 0,65 tamanho de poros, ver Tabela de Materiais) no centro de uma placa de ágar Brucella. Pipetar 4 gotas/filtro e 20 μL/gota de amostra enriquecida no filtro.Coloque as gotas perto do centro do filtro para garantir que o líquido que chega à placa passe pelo filtro, não ao redor do filtro. Coloque as gotas de forma a garantir que não se espalhem e agreguem. Incube gotas à temperatura ambiente durante 15 minutos e remova cuidadosamente os filtros.NOTA: Esta etapa permite tempo suficiente para que as células de Campylobacter atravessem a membrana e alcancem o meio ágar sem secagem excessiva. Incubar placas a 42 °C por aproximadamente 24 h nas condições microaeróbias descritas anteriormente. Escolha colônias características de Campylobacter com características específicas.NOTA: As colônias de Campylobacter são tipicamente arredondadas, com bordas lisas, brilhantes e translúcidas de cor amarelada ou rosada6. Colônias de estrias em placas de ágar Brucella para purificação. Repita esta etapa até obter placas com uma única morfologia uniforme da colônia. Preparar amostras para armazenamento a longo prazo.Prepare o caldo de Bolton conforme descrito anteriormente. Adicione uma colônia da placa com morfologia uniforme da colônia. Crescer durante a noite (24 h) sob condições microaerofílicas descritas anteriormente. Adicionar 900 μL da cultura noturna a 2 mL criovial contendo 100 μL de DMSO. Arrefecer rapidamente num banho seco de gelo-etanol (aprox. -72 °C) durante 10 minutos. Transfira para um congelador de -80 °C para armazenamento a longo prazo. 4. Identificação das espécies de C. jejuni e C. coli Realizar a identificação em nível de espécie de C. jejuni e C. coli utilizando um ensaio de qPCR multiplex (mqPCR) previamente desenvolvido18,19.Realizar lise celular rápida e extração de DNA genômico em formato de placa de 96 poços.NOTA: É altamente recomendável considerar o uso de kits comerciais (consulte a Tabela de Materiais) para garantir que a amostra esteja suficientemente livre de inibidores conhecidos da PCR.Dispersar colônias de Campylobacter purificadas em 100 μL de solução de extração. Lisar amostras a 99 °C durante 10 minutos, seguido de arrefecimento a 20 °C durante 2 minutos num termociclador. Centrifugar a placa a 8.000 x g por 10 min à temperatura ambiente. Remover 2 μL de alíquotas do sobrenadante para o ensaio de mqPCR. Preparar uma mistura de reação de 20 μL consistindo de 10 μL de 2x Master Mix, 2,0 μL de amostra de DNA, 10a 4 cópias do modelo de Controle Interno de Amplificação (IAC) e 200 nM de cada primer e sonda (ver Tabela de Materiais).NOTA: Os primers e sondas de hipO e cdtA são os genes alvo exclusivos para C. jejuni e C. coli, respectivamente. O IAC consiste em um segmento de DNA de 79 pb do adenovírus humano e é incluído como controle positivo para garantir a atividade consistente da DNA polimerase em todas as amostras. Coloque todas as amostras em triplicadas em uma placa óptica de 96 poços coberta com um filme óptico e coloque-as em um sistema de PCR em tempo real (consulte a Tabela de Materiais).Iniciar uma activação de arranque a quente da DNA polimerase a 95 °C durante 10 minutos. Siga com 40 ciclos de desnaturação a 95 °C por 15 s e recozimento/extensão a 60 °C por 1 min. 5. Enumerar suspensões de células Enumere suspensões de células usando um procedimento de placa de descarte 6 x 620. Consulte Arquivo Suplementar 1 para obter imagens que retratam o método de placa de descarte 6 x 6. Placas de ágar Brucella secas ao ar com a tampa desligada em uma capela de fluxo laminar por 45 min. Adicionar 200 μL de suspensão bacteriana a seis fileiras (A-F) na primeira coluna de uma placa de 96 poços. Distribuir 180 μL de meio Brucella pelas seis fileiras das colunas restantes (2-12). Prepare diluições seriadas de dez vezes usando transferências de 20 μL.Por exemplo, transferir 20 μL de amostra da coluna um para a coluna dois. Repita esse processo para um mínimo de 6 colunas. Refluxo Misture cada suspensão dez vezes usando a pipeta, trocando as pontas entre cada transferência. Use uma pipeta multicanal para depositar gotas de 7 μL de seis fileiras de uma coluna na superfície de uma placa de ágar Brucella. Repita para criar uma matriz 6 x 6, garantindo que as linhas sejam replicações técnicas entre colunas. Seque as placas ao ar por 5 min e, em seguida, inverta a placa. Incubar as placas a 42 °C durante 24 horas. Contar o número de colónias em cada diluição representativa.

Representative Results

Efeito da umidade em placas de ágar Brucella para filtração passiva de CampylobacterCampylobacter tem um genoma pequeno e não possui vários genes de resposta ao estresse que ocorrem comumente em outras bactérias, como E. coli O157:H7 e Salmonella. Portanto, é mais sensível a vários estresses ambientais e não tolera a desidratação ou os níveis de oxigênio ambiente. Por outro lado, um meio de ágar excessivamente úmido pode inundar o filtro. Isso não só causa difusão da amostra para fora do filtro, mas também aumenta o tempo de exposição ao oxigênio21. Para determinar as condições apropriadas para o isolamento de Campylobacter em filtro, placas de ágar Brucella foram secas com as tampas removidas por 0 h, 1 h, 2 h e 3 h dentro de um gabinete de segurança biológica e avaliadas quanto à eficiência das células de Campylobacter em atravessar um filtro de 0,65 μm de tamanho de poros. Quatro alíquotas de 20 μL de culturas de C. jejuni S27 nas concentrações de 1,53 x 104 e 1,53 x 105 UFC/mL foram pipetadas em cada membrana filtrante que havia sido colocada sobre uma placa de Brucella. Após 15 min de penetração, os filtros foram removidos e as placas foram incubadas durante a noite para o crescimento celular. As células de 5 placas replicadas foram então contadas e anotadas na Tabela 1. Os resultados indicaram que as placas de ágar secas por 2 h e 3 h tiveram desempenho semelhante, com números quase iguais de células recuperadas da filtração passiva. Notavelmente, as placas secas nessas condições por 0 h e 1 h não permitiram que as células atravessassem completamente a membrana dentro do período de tempo de 15 min utilizado. Comparação de diferentes membranas filtrantes de tamanho de poro para isolar Campylobacter de fígados de frangoConsiderando os tamanhos celulares de Campylobacter (0,5-5 μm de comprimento e 0,2-0,9 μm de largura) e uma ampla gama de tamanhos de partículas de alimentos, filtros de acetato de celulose com tamanhos de poros de 0,45 μm e 0,65 μm foram testados quanto à eficiência de passagem de Campylobacter quando dado um tempo de incubação de 15 min. Amostras de alimentos constituídos por 450 g de fígados de frango fortificados com 153 UFC de C. jejuni e depois enriquecidos durante a noite foram utilizados para o experimento. Como controle sem filtro, o plaqueamento direto da amostra de enriquecimento foi incluído em paralelo. Os resultados (Figura 2) de 5 placas replicadas mostraram consistentemente que o filtro de tamanho de poro de 0,65 μm permitiu que mais células atravessassem do que os filtros de tamanho de poro de 0,45 μm, resultando em aumentos de ~29 vezes mais células obtidas. O filtro de tamanho de poro de 0,45 μm reteve muitas células no lado superior do filtro, resultando em uma recuperação significativamente menor de Campylobacter dos alimentos em comparação com o filtro de tamanho de poro de 0,65 μm. Como esperado, havia um gramado de diferentes organismos de fundo crescendo nas placas de controle sem filtro. Aplicação de filtração passiva no isolamento de Campylobacter de frangos de corteDevido à motilidade incomum das células de Campylobacter , a técnica de filtração passiva foi selecionada para o isolamento de C. jejuni e C. coli de produtos cárneos de varejo, que são tipicamente contaminados com numerosos organismos de fundo. Entre os anos de 2014 e 2023, um total de 79 pacotes de carne crua, incluindo diferentes partes de carne de frango, fígados de frango, fígados de carne bovina e fígados de bezerros, foram coletados em vários supermercados locais. De cada embalagem, 450 g foram amostrados para o isolamento de Campylobacter spp. Combinando o enriquecimento seletivo de Campylobacter em caldo de Bolton contendo sangue e a filtração passiva das células através de um filtro de acetato de celulose de 0,65 μm de tamanho de poro diretamente em uma placa de ágar Brucella, 49 cepas de Campylobacter foram isoladas com sucesso de 79 amostras de carne (Tabela 2). A Figura 3 representa o resultado do isolamento de uma nova cepa de Campylobacter do fígado de galinha. O método tem sido repetidamente provado ser sensível, específico e custo-efetivo. Identificação e diferenciação de isolados de C. jejuni e C. coliPara verificar o gênero e diferenciar as espécies de isolados de Campylobacter obtidos de carne crua, um ensaio de qPCR multiplex amplificando os alvos gênicos específicos (hipO e cdtA) para C. jejuni e C. coli, e um controle interno de amplificação (IAC) foi empregado. O IAC foi incluído como indicador falso-negativo na amplificação simultânea de múltiplos genes. O ensaio foi implementado em um formato de 96 poços com lise celular rápida e extração de DNA usando um reagente comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais). A Tabela 2 resume o resultado da identificação das espécies das cepas de C. jejuni e C. coli . Como verificação adicional, os resultados de sequenciamento do genoma completo confirmaram as espécies de todos os isolados (dados não mostrados). Figura 1: Um diagrama de fluxo de trabalho para o isolamento e identificação de espécies de Campylobacter a partir de carne de varejo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: O impacto do tamanho do filtro na recuperação de Campylobacter. Os resultados indicam que o filtro de 0,65 μm pode recuperar uma média de 900 ± 138 colônias, enquanto o filtro de 0,45 μm recupera 31 ± 7 colônias. Os resultados foram gerados a partir de N = 20 (5 placas com 4 gotas/placa) e o teste t de Student indica que as médias são estatisticamente diferentes (p < 0,0001). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: Isolamento de Campylobacter por filtração passiva de amostras enriquecidas de aves. (A) Representa as quatro gotas de 20 μL de amostra enriquecida depositadas no filtro de membrana de nitrocelulose. A imagem foi coletada durante os 15 min de filtração passiva. (B) Representa a placa após a remoção do filtro de nitrocelulose. Os quatro pontos indicam onde a amostra enriquecida atravessou a membrana. (C) Representa a placa após 24 h de incubação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Tabela 1: Efeito do tempo de secagem das placas de ágar Brucella na filtração passiva de C. jejuni. Clique aqui para baixar esta tabela. Tabela 2: Cepas de C. jejuni e C. coli isoladas de carne crua. Durante o período de 2008 a 2023, 36 cepas de C. jejuni e 13 de C. coli foram isoladas de 79 embalagens de carne em 24 produtos de varejo exclusivos. Clique aqui para baixar esta tabela. Arquivo suplementar 1: imagens durante os processos de isolamento e enumeração. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

Importância do protocolo
C. jejuni e C. coli foram as duas principais espécies de Campylobacter prevalentes em fígados de aves22 e de animais23,24. Neste estudo, amostras de carne de partes de frango (pernas, asas e coxas), fígados de frango e fígados bovinos foram coletadas aleatoriamente durante diferentes períodos de tempo, e de diferentes lojas de varejo e fabricantes para o isolamento de Campylobacter spp. Do total de 49 cepas de Campylobacter isoladas, 36 foram identificadas como C. jejuni e 13 como C. coli, não sendo encontradas outras espécies de Campylobacter, o que é consistente com outros relatos25.

O ensaio é baseado na morfologia celular em forma de espiral e na motilidade característica de saca-rolhas de Campylobacter spp. Uma técnica de filtração passiva simples, porémeficaz26,27, que explorou sua morfologia celular espiral (longa, delgada, 0,2-0,9 por 0,5-5 μm) e forte motilidade em saca-rolhas foi usada para separar Campylobacter de uma mistura de organismos de fundo. A alta motilidade de Campylobacter permitiu que as células atravessassem os filtros de membrana e se movessem em direção a condições favoráveis encontradas dentro do meio ágar, enquanto outros microrganismos de fundo dos produtos cárneos não puderam passar. Este método é relativamente barato, rápido e seletivo, o que o torna adequado para uso em uma variedade de ambientes, incluindo instalações de processamento de alimentos, laboratórios clínicos e laboratórios de pesquisa.

Um artigo pioneiro frequentemente citado afirma que o filtro de 0,45 μm funcionou tão bem que 0,65 μm não foi avaliado28. Os resultados deste estudo indicam que o filtro de tamanho de poro de 0,65 μm teve um desempenho significativamente melhor do que o tamanho de poro de 0,45 μm, resultando em um aumento de 29 vezes no número de células recuperadas do enriquecimento. Isso é importante porque os filtros selecionados não apresentam seletividade reduzida como relatado anteriormente29. Além disso, como se sabe que a filtragem reduzirá significativamente a quantidade de Campylobacter recuperada em comparação com o plaqueamento direto30, portanto, aumentar o tamanho do poro melhora a recuperação do microrganismo, o que é consistente com achados previamente relatados21. Isso é significativo porque todas as células que atravessaram os filtros formaram colônias uniformes de Campylobacter , indicando que ambos os filtros foram suficientes para impedir a passagem de outras microflora e partículas de alimentos. Adicionalmente, o fluxograma FSIS7 observa o potencial de produção prolongada de resultados devido ao reestrangulamento de isolados em placas Campy-Cefex contendo antibióticos. Por outro lado, o protocolo descrito neste manuscrito, que combina o uso de filtração e enriquecimento seletivo com cefoperazona, cicloheximida, trimetoprima e vancomicina, não necessitou de reestrangulamento.

O método atual empregado é consistente com os atuais programas de amostragem e verificação do FSIS17. Como o nível de contaminação por Campylobacter pode ser baixo (153 UFC/450 g de frango), o enxágue é centrifugado para concentrar a amostra por um fator de quatro, o que aumenta a sensibilidade do ensaio. Após concentrar o enxágue por um fator de 4x, as amostras são enriquecidas por 48 h e triadas com o Sistema de Detecção Molecular (MDS) para replicar o método empregado pelos laboratórios FSIS (dados não mostrados). Notavelmente, o método descrito ainda não conseguiu identificar cepas positivas dentro de 24 h que foram detectadas pelo Sistema de Detecção Molecular usando 48 h de enriquecimento (dados não mostrados). Finalmente, um benefício adicional deste protocolo é que ele pode fornecer informações relacionadas à espécie bacteriana e identificar se Campylobacter é C.coli, C. jejuni ou C. lari, enquanto a MDS adotada no MLG 41.07 só pode fornecer uma resposta binária positiva/negativa para Campylobacter.

Etapas críticas
O protocolo de isolamento e identificação de Campylobacter requer precisão durante a centrifugação, filtração e análise molecular. Diluições precisas, condições adequadas de incubação e aderência meticulosa às condições de ensaio de qPCR são fundamentais para a identificação confiável de espécies.

Como bactéria microaerofílica, Campylobacter é muito frágil e sensível a vários estresses ambientais e requer condições únicas de crescimento 31,32,33. Em amostras de alimentos tipicamente submetidas a longos períodos de transporte e armazenamento, muitas células de Campylobacter talvez estejam em estado de dormência ou lesão subletal/letal34,35. Assim, é importante recuperar as células estressadas de suas matrizes alimentares e cultivá-las até uma concentração maior. Na primeira etapa do procedimento, utilizou-se Caldo de Bolton suplementado com sangue de cavalo lacrado e antibióticos para enriquecimento seletivo de Campylobacter a partir de alimentos. A adição sanguínea serviu como agente de têmpera de oxigênio para superar os efeitos adversos dos radicais livres de oxigênio36. Os antibióticos foram utilizados para inibir o crescimento da microflora de fundo37.

Para minimizar o tempo de exposição de Campylobacter ao oxigênio atmosférico ambiente, um período de incubação de 15 min foi selecionado para permitir que as células atravessassem o filtro. Além disso, a umidade da placa de ágar Brucella sob o filtro desempenhou um papel importante na taxa de passagem. Especificamente, os resultados dos testes de placas de ágar secas por 0 h, 1 h, 2 h e 3 h sugeriram que um alto teor de umidade no filtro impedia a passagem das células. Igualmente crítico é a colocação precisa de filtros e gotas nas placas e filtros, ambos influenciando o sucesso do isolamento das células.

Potenciais armadilhas e limitações
Apesar de apresentar uma abordagem estruturada para isolar e identificar espécies de Campylobacter a partir de amostras cruas de frangos, várias limitações deste protocolo merecem atenção. Contaminação externa, placas insuficientemente secas, entupimento de filtros impedindo o movimento microbiano, aprisionamento dos microrganismos dentro do pellet, vedação incompleta da câmara atmosférica e gotas se espalhando além dos limites do filtro estão entre as principais armadilhas.

A separação inadequada dos microrganismos das superfícies dos alimentos ou o seu confinamento na maior parte da amostra pode dificultar o seu isolamento por este método. Além disso, contar com a motilidade microbiana para atravessar através de filtros passivos apresenta uma limitação notável; é possível que as membranas filtrantes tenham retido algumas cepas de Campylobacter menos móveis, pois foi demonstrado que os filtros podem reduzir a eficiência de captura de patógenos microbianos em alimentos38. Outras limitações englobam a natureza em lote dos processos de centrifugação e filtração, a suscetibilidade ao entupimento do filtro e a ineficiência na dispersão do pellet formado, o que afetará a precisão das cargas microbianas. Essas limitações enfatizam coletivamente a necessidade de cautela e metodologias complementares para garantir uma análise abrangente, especialmente quando se trata de tipos variados de amostras ou se busca recursos de alto rendimento.

Sugestões para solução de problemas
Para se antecipar a possíveis problemas, certifique-se inicialmente de que todos os materiais aderem aos padrões de qualidade necessários e não tenham expirado. Solucione problemas de filtros entupidos, potencialmente empregando uma filtração adicional para remover quaisquer grandes contaminantes que possam restringir a passagem do Campylobacter através da membrana de nitrocelulose. Se for observada contaminação, verifique se as gotas não foram colocadas muito perto da borda do filtro e se o líquido chegou ao ágar contornando o filtro em vez de através dos poros. Se não houver crescimento suficiente após o enriquecimento, verifique se as vedações dos recipientes atmosféricos estão apertadas e sem vazamentos.

Potencial de refinamento e expansão
A exploração de materiais filtrantes alternativos pode melhorar a travessia microbiana e permitir que este protocolo seja expandido para uso no isolamento de outros microrganismos móveis de misturas heterogêneas, como alimentos. Identificar controles para reter variantes de Campylobacter menos móveis sem afetar negativamente a especificidade é aconselhável. Além disso, enquanto o ensaio multiplexado de qPCR utilizado neste estudo demonstrou ter a capacidade de detectar C.lari18 , outras espécies de Campylobacter de interesse podem ser incluídas neste ensaio.

Em resumo, através da avaliação de diferentes parâmetros e configurações, foram estabelecidas as condições apropriadas para o isolamento baseado em filtros e identificação em nível de espécie de C. jejuni e C. coli a partir de alimentos. O método demonstrou ser sensível, específico, robusto e custo-efetivo. Ao aplicá-lo em amostras de alimentos reais, o protocolo foi capaz de isolar 36 cepas de C. jejuni e 13 cepas de C. coli de 79 embalagens de carne.

O protocolo está alinhado com a Diretiva FSIS 10.250.117, que descreve o procedimento para amostragem de partes de frango cru, e MLG 41.076 para isolamento e identificação de Campylobacter. Os dados sugerem que concentrar a amostra em 4x e enriquecê-la por 24 h, juntamente com filtração e plaqueamento, produz colônias isoladas e confirmadas dentro de 48 h, em vez de 96 h. O protocolo é compatível com métodos baseados em DNA, como o sequenciamento genômico, para fornecer uma caracterização abrangente das cepas de Campylobacter , incluindo seus perfis de resistência antimicrobiana, predições de virulência e relações filogenéticas. O protocolo representa uma alternativa promissora para a recuperação e isolamento eficiente de Campylobacter spp., a partir de aves cruas, o que pode facilitar estudos epidemiológicos e intervenções de saúde pública.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Esta pesquisa foi apoiada pelo U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Service (USDA-ARS), National Program 108, Current Research Information System números 8072-42000-093 e 8072-42000-094-000-D. A menção de nomes comerciais ou produtos comerciais neste artigo é exclusivamente com o propósito de fornecer informações específicas e não implica recomendação ou endosso pelo Departamento de Agricultura dos EUA. O USDA é um provedor e empregador de oportunidades iguais.

Materials

Agar – Solidifying Agent (Difco) Becton, Dickinson and Company (BD) 281230
Analytical Balance Mettler Toledo JL602-G/L Equipment 
Analytical Balance Mettler Toledo AB54-S Equipment 
Antibiotic supplements cefoperazone, cycloheximide, trimethoprim, vancomycin Oxoid Ltd. SR0183E
Atmosphere Control Gas Pak  (Campy, 85% N2, 10% CO2, and 5% O2) Becton, Dickinson and Company (BD) 260680
Atmosphere Control Vessel,  GasPak EZ CampyPak container system  Becton, Dickinson and Company (BD) 260678
Autoclave – Amsco Lab250, Laboratory Steam Sterilizer Steris plc LV-250 Equipment 
Biological Safety Cabinet, Type A2, Purifier Logic+ Labconco Corporation 302411101 Equipment 
Bolton broth  Oxoid Ltd. CM0983
Brucella broth (Difco) Becton, Dickinson and Company (BD) 211088
Buffered Peptone Water Bio-Rad Laboratories Inc. 3564684
Centrifuge Microcentrifuge 5424 Eppendorf 5424 Equipment
Centrifuge, Avanti J-25 Beckman Coulter, Inc.  Equipment
Chicken thighs, wings, drumsticks, livers Local retailers
DNA Extraction – PreMan Ultra Sample Preparation Reagent  Thermo Fisher Scientific Inc.  4318930
FAM probe for hipO (Sequence 5'-TTGCAACCTCACTAGCAAAATCC
ACAGCT-3')		 Integrated DNA Technologies
Filter – 0.45 µm sterile cellulose acetate filter  Merck-Millipore LTD DAWP04700
Filter – 0.65 µm sterile cellulose acetate filter  Merck-Millipore LTD HAWG04700
forward primer for cdtA (Sequence 5'-TGTCAAACAAAAAACACCAAGCT
T-3' ')		 Integrated DNA Technologies
forward primer for hipO (Sequence 5'-TCCAAAATCCTCACTTGCCATT-3') Integrated DNA Technologies
forward primer for IAC (Sequence 5'-GGCGCGCCTAACACATCT-3') Integrated DNA Technologies
HEX probe for cdtA (Sequence 5'-AAAATTTCCCGCCATACCACTTG
TCCC-3')		 Integrated DNA Technologies
Incubator – Inova 4230 refrigerated incubator shaker New Brunswick Scientific 4230 Equipment 
Inoculating Loop – Combi Loop  10µL and 1µL  Fisher Scientific International, Inc 22-363-602
Internal Amplification Control (IAC) DNA fragment (Sequence 5'-TGGAAGCAATGCCAAATGTGTAT
GTGGTGGCATTGTCTTCTCCC
GTTGTAACTATCCACTGAGATG
TGTTAGGCGCGCC-3')		 Integrated DNA Technologies
Laked horse blood  Remel Inc. R54072
Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+ Mettler Toledo 17014382 Equipment
Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-100XLS+ Mettler Toledo 17014384 Equipment
Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+ Mettler Toledo 17014388 Equipment
Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+ Mettler Toledo 17014391 Equipment
Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+ Mettler Toledo 17014392 Equipment
Manual pipette Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+ Mettler Toledo 17013805 Equipment
Manual pipette Pipet-Lite Multi Pipette L8-20XLS+ Mettler Toledo 17013803 Equipment
Media Storage Bottle -PYREX 1 L Square Glass  Bottle, with GL45 Screw Cap Corning Inc. 1396-1L Equipment
Media Storage Bottle -PYREX 2 L Round Wide Mouth Bottle, with GLS80 Screw Cap Corning Inc. 1397-2L Equipment
Microtiter plate, 96 well plate, flat bottom, polystyrene, 0.34 cm2, sterile, 108/cs MilliporeSigma Z707902
Mixer – Vortex Genie 2 Scientific Industries Inc. SI-0236 Equipment
Motorized pipette controller, PIPETBOY2 INTEGRA Biosciences Corp. Equipment
PCR Mastermix 2× TaqMan Gene Expression  Thermo Fisher Scientific Inc.  4369542
Petri Dish Rotator -  bioWORLD Inoculation Turntable Fisher Scientific International, Inc 3489E20 Equipment
Petri Dishes with Clear Lid (100 mm x 15mm) Fisher Scientific International, Inc FB0875713
Pipette Tips GP LTS 1000µL S 768A/8 Mettler Toledo  30389273
Pipette Tips GP LTS 20µL 960A/10 Mettler Toledo 30389270
Pipette Tips GP LTS 200µL F 960A/10 Mettler Toledo 30389276
Reagent Reservoir, 25 mL sterile reservoir used with multichannel pipettors Thermo Fisher Scientific Inc.  8093-11
Realtime PCR – 7500 Real-Time PCR system  (Applied Biosystems, Foster City, CA) Equipment
reverse primer for cdtA (Sequence 5'-CCTTTGACGGCATTATCTCCTT-3') Integrated DNA Technologies
reverse primer for hipO (Sequence 5'-TGCACCAGTGACTATGAATAACG
A-3')		 Integrated DNA Technologies
reverse primer for IAC (Sequence 5'-TGGAAGCAATGCCAAATGTGTA
-3')		 Integrated DNA Technologies
Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (10 mL) Thermo Fisher Scientific Inc.  170356N
Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (2 mL) Thermo Fisher Scientific Inc.  170372N
Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (25 mL) Thermo Fisher Scientific Inc.  170357N
Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (50 mL) Thermo Fisher Scientific Inc.  170376N
Spreader – Fisherbrand L-Shaped Cell Spreaders Fisher Scientific International, Inc 14-665-230
Stomacher bag, Nasco Whirl-Pak Write-On Homogenizer Blender Filter Bags Thermo Fisher Scientific Inc.  01-812
TAMRA probe for IAC (Sequence 5'-TTACAACGGGAGAAGACAATGCC
ACCA-3')		 Integrated DNA Technologies
Thermocycler (GeneAmp PCR system 9700) Applied Biosystems Equipment
Water Filtration – Elga Veolia Purelab Flex  Elga LabWater PF2XXXXM1-US Equipment
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He, Y., Capobianco, J., Armstrong, C. M., Chen, C., Counihan, K., Lee, J., Reed, S., Tilman, S. Detection and Isolation of Campylobacter spp. from Raw Meat . J. Vis. Exp. (204), e66462, doi:10.3791/66462 (2024).
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