Ex vivo live beeldvorming gebruiken om celdelingen en bewegingen tijdens tandvernieuwing bij muizen te onderzoeken

In de afgelopen twee decennia is de snijtand van muizen naar voren gekomen als een platform van onschatbare waarde voor het onderzoeken van de principes van volwassen stamcelregulatie en tandregeneratie ^1,2. De muizensnijtand groeit continu en vernieuwt zichzelf gedurende het hele leven van het dier. Het doet dit door zowel epitheliale als mesenchymale stamcellen in stand te houden, die zichzelf kunnen vernieuwen en differentiëren in verschillende celtypen van de tand ^1,2. Terwijl tandepitheliale stamcellen aanleiding geven tot ameloblasten, die de glazuurmatrix afscheiden, geven tandheelkundige mesenchymale stamcellen aanleiding tot odontoblasten, cementoblasten en fibroblasten, die respectievelijk dentine, cement en parodontaal ligament vormen 3,4,5,6. Deze constante toevoer van nieuwe cellen handhaaft de weefselhomeostase en maakt de vervanging mogelijk van oude cellen die verloren zijn gegaan als gevolg van kauwslijtage of verwondingen ^7,8. Het ophelderen van de cellulaire en moleculaire mechanismen die het onderhoud en de differentiatie van tandheelkundige stamcellen reguleren, staat daarom centraal in het begrijpen van tandheelkundige regeneratie, een gebied van groeiende belangstelling.

Anatomisch gezien is een groot deel van de snijtand van de volwassen muis ingekapseld in het kaakbot. Terwijl de incisale rand van de tand zichtbaar is, past het apicale uiteinde van de snijtand in een kom en is het stevig bevestigd aan het omringende bot via parodontale ligamenten en bindweefsel (Figuur 1A,B). Het apicale uiteinde van de snijtand is ook het groeigebied van de tand en onderhoudt tandstam- en voorlopercellen in zowel de epitheellaag als de mesenchymale pulpa 9,10,11,12,13. In het bijzonder worden tandepitheelstamcellen gehandhaafd aan het bolvormige uiteinde van het epitheel, bekend als de apicale knop, ook wel de labiale cervicale lus genoemd (Figuur 1C). Net als bij het darmepitheel en de epidermis, wordt de epitheelvernieuwing in de snijtand voornamelijk ondersteund door actief cyclende stamcellen en hun zeer proliferatieve intermediaire afstammelingen, transit-amplificerende cellen 14,15,16,17 genaamd, die zich beide in het binnenste deel van de cervicale lus bevinden. Of het snijtandepitheel tijdens de regeneratie slapende stamcellen bevat en gebruikt, moet echter nog worden bepaald. Daarentegen zijn zowel actieve als slapende dentale mesenchymale stamcellen geïdentificeerd in de apicale pulpa, en de slapende stamcellen functioneren als een reservepopulatie die wordt geactiveerd tijdens het herstel van letsel^13,18.

Veel van de ontdekkingen over de biologie van de vernieuwing en regeneratie van de snijtanden van muizen zijn het resultaat van histologisch onderzoek, waarbij monsters op verschillende tijdstippen worden verkregen, gefixeerd, verwerkt en vervolgens in microndunne plakjes langs een bepaald vlak worden verdeeld. Door gedetailleerde analyse van histologische secties van verschillende muismodellen die het traceren van afstammingslijnen of genetische verstoringen mogelijk maken, hebben wetenschappers de cellijnen van verschillende voorloperpopulaties geïdentificeerd, evenals de genetische en signaalroutes die de homeostase van de snijtanden en het herstel van verwondingen regelen 19,20,21 . De statische tweedimensionale (2D) beelden van niet-vitale cellen in secties kunnen echter niet het volledige spectrum van cellulair gedrag en ruimtelijke organisaties in levend weefsel vastleggen, zoals veranderingen in celvorm, bewegingen en cellulaire kinetiek. Het detecteren en meten van deze snelle cellulaire veranderingen, die optreden op een tijdschaal die onoplosbaar is door weefselsectie, vereist een andere strategie. Bovendien is het verkrijgen van dergelijke informatie ook van cruciaal belang om te begrijpen hoe tandcellen met elkaar omgaan, reageren op verschillende signaalstimuli en zichzelf organiseren om weefselstructuren en -functies te behouden.

De komst van vierdimensionale (4D) diepe weefselbeeldvorming met behulp van twee-fotonmicroscopie²², een technologie die drie ruimtelijke dimensies integreert met temporele resolutie, overwint de inherente beperkingen van histologische analyse door spatiotemporeel onderzoek van gekweekte weefselexplantaten, organoïden of zelfs weefsels in situ mogelijk te maken 23,24,25,26 . 4D live beeldvorming van het zich ontwikkelende tandepitheel heeft bijvoorbeeld de spatiotemporele patronen van celdelingen en migraties onthuld die weefselgroei, signaalcentrumvorming en tandepitheliale morfogenese coördineren 27,28,29,30,31,32. In de snijtand van volwassen muizen is onlangs 4D-beeldvorming aangepast om cellulair gedrag te bestuderen tijdens herstel van tandepitheelletsel. Live beeldvorming onthulde dat stratum intermedium cellen in de suprabasale laag direct kunnen worden omgezet in ameloblasten in de basale laag om het beschadigde epitheel te regenereren, waardoor het traditionele paradigma van herstel van epitheelletsel wordt uitgedaagd¹⁵.

Hier beschrijven we de dissectie, kweek en beeldvorming van de snijtand van volwassen muizen, met de nadruk op epitheelcellen in de labiale cervicale lus (Figuur 1). Deze techniek behoudt de vitaliteit van de tandcellen gedurende meer dan 12 uur en maakt het mogelijk om fluorescerend gelabelde cellen live te volgen met een resolutie van één cel. Deze benadering maakt het mogelijk om celbeweging en -migratie te onderzoeken, evenals dynamische veranderingen in celvorm en delingsoriëntatie onder normale kweekomstandigheden, of in reacties op genetische, fysische en chemische verstoringen.