Enriquecimento rápido e eficiente da microglia medular de camundongos
Summary
As microglias são consideradas algumas das células mais versáteis do organismo, capazes de adaptação morfológica e funcional. Sua heterogeneidade e multifuncionalidade possibilitam a manutenção da homeostase cerebral, além de estarem ligadas a diversas patologias neurológicas. Aqui, uma técnica para purificar a microglia da medula espinhal é descrita.
Abstract
A coluna vertebral define um vertebrado e molda o canal vertebral, uma cavidade que encerra e protege a medula espinhal. O desenvolvimento e a função adequados do sistema nervoso central de mamíferos dependem significativamente da atividade de macrófagos residentes conhecidos como microglia. A microglia apresenta heterogeneidade e multifuncionalidade, permitindo expressão gênica e comportamento distintos dentro da medula espinhal e do cérebro. Numerosos estudos têm explorado a função da microglia cerebral, detalhando extensivamente os métodos de purificação. No entanto, a purificação da micróglia da medula espinhal em camundongos carece de uma descrição abrangente. Em contraste, a utilização de uma colagenase altamente purificada, em oposição a um extrato não refinado, carece de relatos nos tecidos do sistema nervoso central. Neste estudo, a coluna vertebral e a medula espinhal foram excisadas de camundongos C57BL/6 com 8-10 semanas de idade. A digestão subsequente empregou uma colagenase altamente purificada, e a purificação da micróglia utilizou um gradiente de densidade. As células foram submetidas à coloração por citometria de fluxo, avaliando-se viabilidade e pureza através das colorações CD11b e CD45. Os resultados mostraram viabilidade média de 80% e pureza média de 95%. Em conclusão, a manipulação da micróglia de camundongos envolveu digestão com colagenase altamente purificada, seguida de gradiente de densidade. Essa abordagem efetivamente produziu populações substanciais de microglia medular.
Introduction
A característica definidora dos vertebrados é a coluna vertebral ou coluna vertebral, na qual a notocorda foi substituída por uma sequência de ossos segmentados chamados vértebras, divididos por discos intervertebrais. Essa sucessão de material ósseo forma o canal vertebral, uma cavidade que envolve e protege a medula espinhal1. No gênero Rodentia, a coluna vertebral é geralmente formada por sete vértebras cervicais, treze vértebras torácicas, seis vértebras lombares e um número variável de vértebrascaudais2,3. O comprimento da medula espinhal é semelhante ao da coluna vertebral, e o filo terminal é uma estrutura não nervosa que ancora a medula espinhal ao sacro. Além disso, as fibras nervosas saem pelo forame intervertebral1.
O desenvolvimento e o funcionamento adequado do sistema nervoso central em mamíferos dependem criticamente da atividade dos macrófagos residentes no sistema nervoso, chamados de micróglia4. Embora as microglias tenham sido inicialmente descritas como fagócitos residentes no cérebro, pesquisas recentes têm atribuído muitas funções dinâmicas a essascélulas5,6. O tamanho da microglia varia de 7 a 10 μm na homeostase; São consideradas células mais versáteis do organismo e podem adaptar-se morfológica e funcionalmente ao seu ambiente em constantemudança7. Essas células exibem alta heterogeneidade tanto na fase embrionária quanto naadulta8,9, enquanto na fase adulta também apresentam complexa heterogeneidade funcional baseada em seu contexto espaço-temporal10. A heterogeneidade e as múltiplas funções da microglia permitem a expressão gênica e o comportamento diferenciais na medula espinhal e no cérebro. Foi demonstrado que a expressão de CD11b, CD45, CD86 e CCR9 é maior na medula espinhal em comparação com o cérebro 8,9.
Existem múltiplos protocolos para o isolamento da microglia cerebral11,12; entretanto, existem poucos para a microglia medular13,14. A otimização de um método para purificar a microglia da medula espinhal facilita o desenvolvimento de múltiplos estudos focados na descoberta da fisiologia da microglia. Este protocolo tem como objetivo descrever uma extração simples e altamente reprodutível da medula espinhal de camundongos e a purificação da micróglia (Figura 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Inúmeros protocolos têm sido desenvolvidos para o estudo da micróglia devido à sua importância na homeostase cerebral. Nesses métodos, as microglias são tipicamente originadas dos hemisférios cerebrais de ratos embrionários ou neonatais e camundongos17. Um número limitado de estudos abordou a purificação da micróglia da medula espinhal de camundongos adultos13,14. Essas técnicas envolvem digestão enzimática usando colagenas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por bolsas do Conselho Nacional de Ciência e Tecnologia (CONACYT) (702361). Os autores agradecem o programa de Doutoramento em Ciências Químicas Biológicas da Escola Nacional de Ciências Biológicas do Instituto Politécnico Nacional.
Materials
| 15 mL collection tubes | Corning, USA | 430790 | |
| 2 mL microtubes | Axygen, USA | MCT-200-G | |
| 2.4G2 anti-FcR | BioLegend, USA | 101302 | |
| 50 mL collection tubes | Corning, USA | 430829 | |
| 70% ethanol | |||
| Antibiotic-Antimycotic (penicillin, streptomycin, amphotericin b) | Gibco, USA | 15240062 | |
| Antibody CD11b eFluor 450 anti-mouse | eBioscience, USA | 48-0112 | |
| Antibody CD45 PerCP anti-mouse | BioLegend, USA | 103130 | |
| Balanced salt solution (PBS) calcium- magnesium-free | Corning, USA | 46-013-CM | |
| Blue Cell Strainer 40 μm | Corning, USA | 352340 | |
| Costar 6-well Clear Not Treated | Corning, USA | CLS3736 | |
| Coverslips | |||
| Digital Heating Shaking Drybath | Thermo Scientific Digital HS Drybath, USA | 88870001 | |
| Dissecting forceps for microsurgery | FT by DUMONT | ||
| DNase | Roche, USA | 4536282001 | |
| Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium-high glucose (DMEM) | Merck, USA | D6429 | |
| Electric shaver | |||
| FACS tube | Thermo, USA | 352058 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | PAN Biotech, Alemania | P30-3306 | |
| Flow cytometer Cytoflex | Beckman Coulter | ||
| Hank’s balanced salt solution | Merck, USA | H2387 | |
| L-glutamine | Corning, USA | 15393631 | |
| Liberase TM | Roche, USA | 5401119001 | |
| Neubauer chamber Counting Chambers | China | 1103 | |
| Pentobarbital | |||
| Percoll | Merck, USA | 17089101 | density gradient centrifugation |
| Poly-L-lysine solution | Merck, USA | P8920 | |
| Scalpel No. 25 | HERGOM, Mexico | H23 | |
| Snaplock Microcentrifuge Tubes 2 mL | Axygen, USA | 10011-680 | |
| Stereoscopic microscope | Velab, Mexico | HG927831 | |
| Straight surgical scissors (10 cm) | HERGOM, Mexico | ||
| Straight Vannas scissors | HERGOM, Mexico | ||
| Triton X100 | Merck, USA | X100 | |
| Trypan blue Stain 0.4% | Merck, USA | 15250-061 | |
| Vortex mixer | DLAB, China | 8031102000 | |
| Zombie Aqua Fixable Viability Kit | BioLegend, USA | 423102 | amine-reactive fluorescent dye staining |
References
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