Summary

Isolement par affinité chimique de vésicules extracellulaires à partir de biofluides pour l’analyse protéomique et phosphoprotéomique

Published: October 27, 2023
doi:

Summary

Le présent protocole fournit des descriptions détaillées pour l’isolement efficace des vésicules extracellulaires urinaires à l’aide de billes magnétiques fonctionnalisées. De plus, il englobe des analyses ultérieures, y compris le western blot, la protéomique et la phosphoprotéomique.

Abstract

Les vésicules extracellulaires (VE) issues de biofluides ont récemment fait l’objet d’une attention particulière dans le domaine de la biopsie liquide. Libérés par presque tous les types de cellules, ils fournissent un instantané en temps réel des cellules hôtes et contiennent une multitude d’informations moléculaires, y compris les protéines, en particulier celles présentant des modifications post-traductionnelles (PTM) telles que la phosphorylation, en tant que principal acteur des fonctions cellulaires et de l’apparition et de la progression de la maladie. Cependant, l’isolement des VE des biofluides reste difficile en raison des faibles rendements et des impuretés des méthodes actuelles d’isolation des VE, ce qui rend difficile l’analyse en aval de la cargaison des VE, comme les phosphoprotéines des VE. Nous décrivons ici une méthode d’isolement rapide et efficace des VE basée sur des billes magnétiques fonctionnalisées pour l’isolement des VE à partir de biofluides tels que l’urine humaine et l’analyse protéomique et phosphoprotéomique en aval après l’isolement des VE. Le protocole a permis un rendement élevé de récupération des VE urinaires et des profils sensibles du protéome et du phosphoprotéome des VE. En outre, la polyvalence de ce protocole et les considérations techniques pertinentes sont également abordées ici.

Introduction

Les vésicules extracellulaires (VE) sont des nanoparticules encapsulées dans une membrane sécrétées par tous les types de cellules et présentes dans les biofluides tels que le sang, l’urine, la salive, etc.1,2,3,4. Les VE transportent une cargaison de diverses molécules bioactives qui reflètent l’état physiologique et pathologique de leurs cellules hôtes et fonctionnent donc comme des facteurs cruciaux dans la progression de la maladie 4,5,6. De plus, des études approfondies ont établi que les marqueurs de la maladie basés sur les VE peuvent être identifiés avant l’apparition des symptômes ou la détection physiologique des tumeurs 5,6,7.

La phosphorylation agit comme un mécanisme clé dans la signalisation et la régulation cellulaires. Par conséquent, les phosphoprotéines constituent une source précieuse pour la découverte de biomarqueurs, car les événements de phosphorylation aberrants sont associés à des voies de signalisation cellulaire déréglées et au développement de maladies métastatiques telles que le cancer 8,9,10. Bien que le profilage de la dynamique de phosphorylation permette d’identifier des signatures phosphoprotéiques spécifiques à la maladie en tant que biomarqueurs potentiels, la faible abondance et la nature dynamique des phosphoprotéines posent des défis majeurs dans le développement de phosphoprotéines en tant que biomarqueurs11,12. Notamment, les phosphoprotéines peu abondantes encapsulées dans les VE sont protégées de la digestion enzymatique externe dans l’environnement extracellulaire8. Par conséquent, les VE et les phosphoprotéines dérivées des VE constituent une source idéale pour la découverte de biomarqueurs dans la détection précoce du cancer et d’autres maladies.

Bien que l’analyse de la phosphorylation des protéines dans les VE offre une ressource précieuse pour comprendre la signalisation du cancer et le diagnostic précoce de la maladie, le manque de méthodes efficaces d’isolement des VE constitue un obstacle majeur. L’isolation des VE est généralement obtenue par ultracentrifugation différentielle (DUC)13. Cependant, cette méthode prend du temps et n’est pas adaptée aux implications cliniques en raison d’un faible débit et d’une mauvaise reproductibilité13,14. D’autres approches d’isolement des VE, telles que la précipitation induite par les polymères15, sont limitées par une faible spécificité due à la coprécipitation de protéines non VE. Les approches basées sur l’affinité, y compris la capture d’affinité basée sur les anticorps16 et la filtration d’affinité17, offrent une spécificité accrue, mais sont limitées à un taux de récupération relativement faible en raison du faible volume.

Pour répondre aux enjeux de l’exploration de la dynamique des phosphoprotéines dans les VE, notre groupe a développé une technique de récupération et de purification totale des vésicules extracellulaires (EVtrap) basée sur l’affinité chimique pour capturer les VE sur des billes magnétiques fonctionnalisées18. Des résultats antérieurs ont démontré que cette méthode d’isolement des VE à base de billes magnétiques est très efficace pour isoler les VE d’une large gamme d’échantillons de biofluides et qu’elle est capable d’obtenir un rendement beaucoup plus élevé tout en minimisant la contamination par rapport à la DUC et à d’autres méthodes d’isolement existantes18,19. Nous avons utilisé avec succès EVtrap et une méthode d’enrichissement en phosphopeptide à base de titane développée par notre groupe20 pour profiler le phosphoprotéome des VE dérivés de divers biofluides et pour détecter des biomarqueurs phosphoprotéiques potentiels pour diverses maladies 19,21,22.

Nous présentons ici un protocole basé sur EVtrap pour l’isolement des VE en circulation. Le protocole se concentre sur les VE urinaires. Nous démontrons également la caractérisation de VE isolés à l’aide du western blot. Nous détaillons ensuite la préparation des échantillons et l’acquisition par spectrométrie de masse (MS) pour les analyses protéomiques et phosphoprotéomiques. Ce protocole fournit un flux de travail efficace et reproductible pour le profilage du protéome et du phosphoprotéome urinaires des VE, ce qui facilitera d’autres études sur les VE et leurs applications cliniques23.

Protocol

Tous les échantillons d’urine ont été prélevés sur des personnes en bonne santé après consentement éclairé. Les expériences étaient conformes à toutes les normes éthiques impliquant des échantillons humains et aux directives du programme de protection de la recherche humaine de l’Université Purdue. 1. Prélèvement d’échantillons Centrifuger 12 mL d’échantillon d’urine dans un tube à centrifuger conique de 15 mL pendant 10 min à 2 500 x <…

Representative Results

Ce protocole illustre un flux de travail complet allant de l’isolement des VE aux analyses protéomiques et phosphoprotéomiques en aval (Figure 1). Les échantillons d’urine en trois exemplaires ont été soumis à l’isolement des véhicules électriques. Les VE isolés ont été caractérisés par transfert Western, puis traités pour la préparation d’échantillons protéomiques par spectrométrie de masse, y compris l’extraction de protéines, la digestion enzymatique et le net…

Discussion

L’isolement efficace des VE est une condition préalable essentielle à la détection de protéines et de phosphoprotéines peu abondantes dans les VE. Malgré le développement de nombreuses méthodes pour répondre à ce besoin, la majorité d’entre eux souffrent encore de limitations telles qu’une mauvaise récupération ou une faible reproductibilité, ce qui entrave leur utilisation dans les études à grande échelle et les contextes cliniques de routine. Le DUC est généralement considéré comme la méthod…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ces travaux ont été financés en partie par les subventions 3RF1AG064250 et R44CA239845 du NIH.

Materials

1.5 mL microcentrifuge tube Life Science Products M-1700C-LB
1.5 mL tube magnetic separator rack Sergi Lab Supplies 1005
15 mL conical centrifuge tube Corning  352097
15 mL tube magnetic separator rack Sergi Lab Supplies 1002
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7074P2
Benchtop incubated shaker Bioer DIS-87999-3367802 Bioer Thermocell Mixing Block MB-101
CD9 (D3H4P) Rabbit mAb Cell Signaling Technology 13403S
Chloroacetamide Sigma -Aldrich C0267-100G Used for alkylation of reduced sulfide groups. Freshly prepare 400 mM in water as stock solution.
Ethyl acetate  Fisher Scientific  E145-4 Precipitates detergents
Evosep One  Evosep Liquid chromatography system
Evotips Evosep EV2013 Sample loading for Evosep One system 
EVtrap Tymora Analytical Functionalized magnetic beads, loading buffer, and washing buffer 
Immobilon-FL PVDF Membrane Sigma -Aldrich IPFL00010 Blotting membrane 
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel Invitrogen NP0322BOX Invitrogen NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 12-well
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) Invitrogen NP0007
PBS ThermoFisher 10010023
Pepsep C18 15 x 75 x 1.9 Bruker  1893473 Separation column 
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 Sigma -Aldrich P5726-5ML 100X, Phosphotase inhibitor.
Phosphatase Inhibitor Cocktail 3 Sigma -Aldrich P0044-1ML 100X,  Phosphotase inhibitor. 
Pierce BCA Protein Assay Kit ThermoFisher 23225
Pierce ECL Western Blotting Substrate ThermoFisher 32106 HRP substrate 
PolyMAC phosphopeptide enrichment kit Tymora Analytical Polymer-based metal ion affinity capture (PolyMAC) for phosphopeptide enrichment
Sodium deoxycholate  Sigma -Aldrich D6750-10G Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution.
Sodium lauroyl sarcosinate  Sigma -Aldrich L9150-50G Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution.
timsTOF HT Bruker Trapped ion-mobility time-of-flight mass spectrometry
TopTip C-18 (10-200 μL) tips  Glygen TT2C18.96 Desalting method
Triethylamine Sigma -Aldrich 471283-100ML For EV elution. 
Triethylammonium bicabonate buffer Sigma -Aldrich T7408-100ML 1 M
Trifluoroacetic acid Sigma -Aldrich 302031-100ML
Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride Sigma -Aldrich C4706 Used for reducion of disulfide bonds. Prepare 200 mM in water as stock solution. Aliquot the stock solution into small volume and store it in at-20°C (avoid multiple freeze-thaw cycles).
Trypsin/Lys-C MIX ThermoFisher PIA41007

References

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Liu, Y., Luo, Z., Iliuk, A., Tao, W. A. Chemical Affinity-Based Isolation of Extracellular Vesicles from Biofluids for Proteomics and Phosphoproteomics Analysis. J. Vis. Exp. (200), e65844, doi:10.3791/65844 (2023).

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