בדיקת תרופות במולקולות קטנות בתפוקה גבוהה להפרעות שינה הקשורות לגיל באמצעות Drosophila melanogaster
Summary
מוצג פרוטוקול לבדיקת תרופות בתפוקה גבוהה לשיפור השינה על ידי ניטור התנהגות השינה של זבובי פירות במודל דרוזופילה קשיש.
Abstract
שינה, מרכיב חיוני של בריאות ורווחה כללית, מציבה לעתים קרובות אתגרים לאנשים מבוגרים שחווים לעתים קרובות הפרעות שינה המאופיינות במשך שינה מקוצר ודפוסים מקוטעים. הפרעות שינה אלה קשורות גם לסיכון מוגבר למחלות שונות בקרב קשישים, כולל סוכרת, מחלות לב וכלי דם והפרעות פסיכולוגיות. למרבה הצער, התרופות הקיימות להפרעות שינה קשורות לתופעות לוואי משמעותיות כגון פגיעה קוגניטיבית והתמכרות. כתוצאה מכך, יש צורך דחוף בפיתוח תרופות חדשות, בטוחות ויעילות יותר להפרעות שינה. עם זאת, העלות הגבוהה ומשך הניסוי הממושך של שיטות סינון התרופות הנוכחיות נותרו גורמים מגבילים.
פרוטוקול זה מתאר שיטת סינון חסכונית ובעלת תפוקה גבוהה המשתמשת ב- Drosophila melanogaster, מין בעל מנגנון ויסות שינה שמור מאוד בהשוואה ליונקים, מה שהופך אותו למודל אידיאלי לחקר הפרעות שינה אצל קשישים. על-ידי מתן תרכובות קטנות שונות לזבובים מזדקנים, אנו יכולים להעריך את השפעתם על הפרעות שינה. התנהגויות השינה של זבובים אלה נרשמות באמצעות מכשיר ניטור אינפרא אדום ומנותחות באמצעות חבילת הנתונים בקוד פתוח Sleep and Circadian Analysis MATLAB Program 2020 (SCAMP2020). פרוטוקול זה מציע גישת סינון זולה, ניתנת לשחזור ויעילה לוויסות שינה. זבובי פירות, בשל מחזור החיים הקצר שלהם, עלות הגידול הנמוכה וקלות הטיפול, משמשים כנושאים מצוינים לשיטה זו. לשם המחשה, רסרפין, אחת התרופות שנבדקו, הדגימה את היכולת לקדם את משך השינה אצל זבובים קשישים, והדגישה את יעילותו של פרוטוקול זה.
Introduction
שינה, אחת ההתנהגויות החיוניות להישרדות האדם, מאופיינת בשני מצבים עיקריים: שינה של תנועת עיניים מהירה (REM) ושינה של תנועת עיניים לא מהירה (NREM)1. שנת NREM מורכבת משלושה שלבים: N1 (המעבר בין ערות לשינה), N2 (שינה קלה) ו-N3 (שינה עמוקה, שנת גלים איטיים), המייצגים את ההתקדמות מעירות לשינה עמוקה1. שינה ממלאת תפקיד מכריע בבריאות הגופנית והנפשית2. עם זאת, הזדקנות מפחיתה את משך השינה הכולל, יעילות השינה, אחוז השינה בגלים איטיים ואחוז שנת REM אצל מבוגרים3. אנשים מבוגרים נוטים לבלות יותר זמן בשינה קלה בהשוואה לשנת גלים איטיים, מה שהופך אותם לרגישים יותר להתעוררויות ליליות. ככל שמספר ההתעוררויות עולה, זמן השינה הממוצע יורד, וכתוצאה מכך דפוס שינה מקוטע אצל קשישים, אשר עשוי להיות קשור לעירור יתר של נוירוני Hcrt בעכברים4. נוסף על כך, ירידה תלוית גיל במנגנונים צירקדיים תורמת לשינוי מוקדם יותר במשך השינה 5,6. בשילוב עם מחלות פיזיות, לחץ פסיכולוגי, גורמים סביבתיים ושימוש בתרופות, גורמים אלה הופכים מבוגרים לרגישים יותר להפרעות שינה, כגון נדודי שינה, הפרעת התנהגות בשינה REM, נרקולפסיה, תנועות רגליים תקופתיות, תסמונת רגליים חסרות מנוחה והפרעות נשימה בשינה 7,8.
מחקרים אפידמיולוגיים הראו כי הפרעות שינה קשורות קשר הדוק למחלות כרוניות בקרב קשישים9, כולל דיכאון 10, מחלות לב וכלי דם11 ודמנציה12. לטיפול בהפרעות שינה תפקיד מכריע בשיפור וטיפול במחלות כרוניות ובשיפור איכות החיים של אנשים מבוגרים. כיום, חולים מסתמכים בעיקר על תרופות כגון בנזודיאזפינים, שאינם בנזודיאזפינים ואגוניסטים לקולטני מלטונין כדי לשפר את איכות השינה13. עם זאת, בנזודיאזפינים יכולים להוביל לירידה ברגולציה של קולטנים ותלות לאחר שימוש ארוך טווח, מה שגורם לתסמיני גמילה חמורים עם הפסקת14,15. תרופות שאינן בנזודיאזפינים נושאות גם סיכונים, כולל דמנציה 16, שברים17 וסרטן18. אגוניסט קולטן מלטונין נפוץ, ramelteon, מפחית את חביון השינה אבל לא מאריך את משך השינה ויש לו חששות הקשורים לתפקוד הכבד עקב חיסול נרחב של מעבר ראשון19. אגומלטין, אגוניסט לקולטן מלטונין ואנטגוניסט לקולטן סרוטונין, משפר נדודי שינה הקשורים לדיכאון אך גם מהווה סיכון לנזק לכבד20. כתוצאה מכך, יש צורך דחוף בתרופות בטוחות יותר לטיפול או הקלה על הפרעות שינה. עם זאת, אסטרטגיות סינון התרופות הנוכחיות, המבוססות על ניסויים מולקולריים ותאיים בשילוב עם מערכות אוטומטיות וניתוח ממוחשב, הן יקרות וגוזלות זמןרב 21. אסטרטגיות תכנון תרופות מבוססות מבנה, המסתמכות על מבנה הקולטן ותכונותיו, דורשות הבנה ברורה של המבנה התלת-ממדי של הקולטן וחסרות יכולות ניבוי להשפעות התרופה22.
בשנת 2000, בהתבסס על קריטריוני השינה שהוצעו על ידי קמפבל וטובלר בשנת 1984 23, חוקרים הקימו מודלים פשוטים של בעלי חיים כדי לחקור שינה 24, כולל Drosophila melanogaster, אשר הציג מצבים דמויי שינה25,26. למרות ההבדלים האנטומיים בין דרוזופילה לבני אדם, מרכיבים נוירוכימיים רבים ומסלולי איתות המווסתים את השינה בדרוזופילה נשמרים בשנת יונקים, מה שמקל על חקר מחלות נוירולוגיות אנושיות 27,28. דרוזופילה נמצאת בשימוש נרחב גם במחקרי שעון ביולוגי, למרות הבדלים במתנדי הליבה בין זבובים ליונקים 29,30,31. לכן, דרוזופילה משמשת כאורגניזם מודל רב ערך לחקר התנהגות השינה וביצוע בדיקות סקר הקשורות לשינה.
מחקר זה מציע גישה חסכונית ופשוטה מבוססת פנוטיפ לסינון תרופות במולקולות קטנות לטיפול בהפרעות שינה באמצעות זבובים מזדקנים. ויסות השינה בדרוזופילה נשמר מאוד25, והירידה בשינה שנצפתה עם הגיל עשויה להיות הפיכה באמצעות מתן תרופות. לפיכך, שיטת סינון זו המבוססת על פנוטיפ שינה יכולה לשקף באופן אינטואיטיבי את יעילות התרופה. אנו מאכילים את הזבובים בתערובת של התרופה הנחקרת ומזון, מנטרים ומתעדים התנהגות שינה באמצעות Drosophila Activity Monitor (DAM)32, ומנתחים את הנתונים שנרכשו באמצעות חבילת הנתונים SCAMP2020 בקוד פתוח ב-MATLAB (איור 1). ניתוח סטטיסטי מתבצע באמצעות סטטיסטיקה ותוכנות גרפים (ראה טבלת חומרים). לדוגמה, אנו מדגימים את יעילותו של פרוטוקול זה על ידי הצגת נתונים ניסיוניים על Reserpine, מעכב מולקולות קטנות של טרנספורטר מונואמין שלפוחית שדווח כמגביר שינה33. פרוטוקול זה מספק גישה חשובה לזיהוי תרופות לטיפול בבעיות שינה הקשורות לגיל.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטה המתוארת מתאימה לסינון מהיר של תרופות שינה קטנות ובינוניות. כיום, רוב שיטות סינון התרופות המקובלות בתפוקה גבוהה מבוססות על רמות ביוכימיות ותאיות. לדוגמה, המבנה והתכונות של הקולטן נבדקים כדי לחפש ליגנדות ספציפיות שיכולות להיקשר אליו22. גישה אחרת כוללת ניתוח מצב הקשירה וה?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לחברי מעבדתו של פרופ’ ג’ונהאי האן על הדיון וההערות. עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין 32170970 ל- Y.T ו”פרויקט כחול ציאנין” של מחוז ג’יאנגסו ל- Z.C.Z.
Materials
| Ager | BIOFROXX | 8211KG001 | |
| Artificial Climate Box | PRANDT | PRX-1000A | official website:https://www.nbplt17.com/PLTXBS-Products-20643427/ |
| DAM2 Drosophila Activity Monitor | TriKineics | DAM2 | official website:https://www.trikinetics.com/ |
| DAM2system | TriKineics | version:v3.03 | official website:https://www.trikinetics.com/ |
| DAMFileScan | TriKineics | version:1.0.7.0 | official website:https://www.trikinetics.com/ |
| Dimethyl Sulfoxide | SIGMA | 276855 | |
| Drosophila Activity Monitoring Incubator | Tritech Research | DT2-CIRC-TK | official website:https://www.tritechresearch.com/DT2-CIRC-TK.html |
| Drosophila Bottles | Biologix | 51-17720 | official website:http://biologixgroup.com/goods.php?id=48 |
| Drosophila: w1118 | Bloomington Drosophila Stock Center | BDSC_3605 | |
| Excel | Microsoft | version:Excel 2016 | official website:https://www.microsoftstore.com.cn/software/office/excel |
| Glass tubes | TriKinetics | PPT5x65 | official website:https://www.trikinetics.com/ |
| MATLABR2022b | MathWorks | version:9.13.0.2049777 | official website:https://ww2.mathworks.cn/products/matlab.html |
| Prism | GraphPad | Version:Prism 8.0.1 | official website:https://www.graphpad.com/features |
| Reserpine | MACKLIN | R817202-1g | |
| Saccharose | SIGMA | 1245GR500 | |
| SCAMP | Vecsey Lab | N/A | official website:https://academics.skidmore.edu/blogs/cvecsey/ |
References
- Le Bon, O. Relationships between REM and NREM in the NREM-REM sleep cycle: a review on competing concepts. Sleep Medicine. 70, 6-16 (2020).
- Krueger, J. M., Frank, M. G., Wisor, J. P., Roy, S. Sleep function: Toward elucidating an enigma. Sleep Medicine Reviews. 28, 46-54 (2016).
- Ohayon, M. M., Carskadon, M. A., Guilleminault, C., Vitiello, M. V. Meta-analysis of quantitative sleep parameters from childhood to old age in healthy individuals: developing normative sleep values across the human lifespan. Sleep. 27 (7), 1255-1273 (2004).
- Li, S. B., et al. Hyperexcitable arousal circuits drive sleep instability during aging. Science. 375 (6583), eabh3021 (2022).
- Rodriguez, J. C., Dzierzewski, J. M., Alessi, C. A. Sleep problems in the elderly. Medical Clinics of North America. 99 (2), 431-439 (2015).
- Gulia, K. K., Kumar, V. M. Sleep disorders in the elderly: a growing challenge. Psychogeriatrics. 18 (3), 155-165 (2018).
- Wolkove, N., Elkholy, O., Baltzan, M., Palayew, M. Sleep and aging: 1. Sleep disorders commonly found in older people. Canadian Medical Association Journal. 176 (9), 1299-1304 (2007).
- Suzuki, K., Miyamoto, M., Hirata, K. Sleep disorders in the elderly: Diagnosis and management. Journal of General and Family Medicine. 18 (2), 61-71 (2017).
- Foley, D. J., et al. Sleep complaints among elderly persons – an epidemiologic-study of 3 communities. Sleep. 18 (6), 425-432 (1995).
- Yu, D. S. Insomnia Severity Index: psychometric properties with Chinese community-dwelling older people. Journal of Advanced Nursing. 66 (10), 2350-2359 (2010).
- Hoevenaar-Blom, M. P., Spijkerman, A. M., Kromhout, D., van den Berg, J. F., Verschuren, W. M. Sleep duration and sleep quality in relation to 12-year cardiovascular disease incidence: the MORGEN study. Sleep. 34 (11), 1487-1492 (2011).
- Rebok, G. W., Rovner, B. W., Folstein, M. F. Sleep disturbance and Alzheimer’s disease: relationship to behavioral problems. Aging (Milano). 3 (2), 193-196 (1991).
- Schroeck, J. L., et al. Review of safety and efficacy of sleep medicines in older adults. Clinical Therapeutics. 38 (11), 2340-2372 (2016).
- Pericic, D., Strac, D. S., Jembrek, M. J., Vlainic, J. Allosteric uncoupling and up-regulation of benzodiazepine and GABA recognition sites following chronic diazepam treatment of HEK 293 cells stably transfected with alpha1beta2gamma2S subunits of GABA (A) receptors. Naunyn-Schmiedeberg’s Archives of Pharmacology. 375 (3), 177-187 (2007).
- Lader, M. History of benzodiazepine dependence. Journal of Substance Abuse Treatment. 8 (1-2), 53-59 (1991).
- Chen, P. L., Lee, W. J., Sun, W. Z., Oyang, Y. J., Fuh, J. L. Risk of dementia in patients with insomnia and long-term use of hypnotics: a population-based retrospective cohort study. Plos One. 7 (11), e49113 (2012).
- Kang, D. Y., et al. Zolpidem use and risk of fracture in elderly insomnia patients. Journal of Preventive Medicine and Public Health. 45 (4), 219-226 (2012).
- Kao, C. H., et al. Relationship of zolpidem and cancer risk: a Taiwanese population-based cohort study. Mayo Clinic Protocols. 87 (5), 430-436 (2012).
- Sateia, M. J., Kirby-Long, P., Taylor, J. L. Efficacy and clinical safety of ramelteon: an evidence-based review. Sleep Medicine Reviews. 12 (4), 319-332 (2008).
- Friedrich, M. E., et al. Drug-induced liver injury during antidepressant treatment: results of amsp, a drug surveillance program. The International Journal of Neuropsychopharmacology. 19 (4), pyv126 (2016).
- Entzeroth, M., Flotow, H., Condron, P. Overview of high-throughput screening. Current Protocols in Pharmacology. Chapter 9, (2009).
- Ferreira, L. G., Dos Santos, R. N., Oliva, G., Andricopulo, A. D. Molecular docking and structure-based drug design strategies. Molecules. 20 (7), 13384-13421 (2015).
- Campbell, S. S., Tobler, I. Animal sleep – a review of sleep duration across phylogeny. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 8 (3), 269-300 (1984).
- Hendricks, J. C., Sehgal, A., Pack, A. I. The need for a simple animal model to understand sleep. Progress in Neurobiology. 61 (4), 339-351 (2000).
- Hendricks, J. C., et al. Rest in Drosophila is a sleep-like state. Neuron. 25 (1), 129-138 (2000).
- Shaw, P. J., Cirelli, C., Greenspan, R. J., Tononi, G. Correlates of sleep and waking in Drosophila melanogaster. Science. 287 (5459), 1834-1837 (2000).
- Ly, S., Pack, A. I., Naidoo, N. The neurobiological basis of sleep: Insights from Drosophila. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 87, 67-86 (2018).
- Jeibmann, A., Paulus, W. Drosophila melanogaster as a model organism of brain diseases. International Journal of Molecular Sciences. 10 (2), 407-440 (2009).
- Morse, D., Sassone-Corsi, P. Time after time: inputs to and outputs from the mammalian circadian oscillators. Trends in Neuroscience. 25 (12), 632-637 (2002).
- De Nobrega, A. K., Lyons, L. C. Drosophila: an emergent model for delineating interactions between the circadian clock and drugs of abuse. Neural Plasticity. 2017, 4723836 (2017).
- Reppert, S. M., Weaver, D. R. Coordination of circadian timing in mammals. Nature. 418 (6901), 935-941 (2002).
- Koudounas, S., Green, E. W., Clancy, D. Reliability and variability of sleep and activity as biomarkers of ageing in Drosophila. Biogerontology. 13 (5), 489-499 (2012).
- Nall, A. H., Sehgal, A. Small-molecule screen in adult Drosophila identifies VMAT as a regulator of sleep. Journal of Neuroscience. 33 (19), 8534-8464 (2013).
- Jin, X., Gu, P., Han, J. Protocol for Drosophila sleep deprivation using single-chip board. STAR Protocols. 2 (4), 100827 (2021).
- Kashyap, A., Singh, P. K., Silakari, O. Counting on fragment based drug design approach for drug discovery. Current Topics in Medicinal Chemistry. 18 (27), 2284-2293 (2018).
- Qi, W., Ding, D., Salvi, R. J. Cytotoxic effects of dimethyl sulphoxide (DMSO) on cochlear organotypic cultures. Hearing Research. 236 (1-2), 52-60 (2008).
- Nishimura, M., Ueda, N., Naito, S. Effects of dimethyl sulfoxide on the gene induction of cytochrome P450 isoforms, UGT-dependent glucuronosyl transferase isoforms, and ABCB1 in primary culture of human hepatocytes. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 26 (7), 1052-1056 (2003).
- Solovev, I. A., Shaposhnikov, M. V., Moskalev, A. A. Chronobiotics KL001 and KS15 extend lifespan and modify circadian rhythms of Drosophila melanogaster. Clocks Sleep. 3 (3), 429-441 (2021).
- Cavas, M., Beltran, D., Navarro, J. F. Behavioural effects of dimethyl sulfoxide (DMSO): changes in sleep architecture in rats. Toxicology Letters. 157 (3), 221-232 (2005).
- Pfeiffenberger, C., Lear, B. C., Keegan, K. P., Allada, R. Locomotor activity level monitoring using the Drosophila Activity Monitoring (DAM) System. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (11), 5518 (2010).
- Gilestro, G. F. Video tracking and analysis of sleep in Drosophila melanogaster. Nature Protocols. 7 (5), 995-1007 (2012).
- Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nature Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
- Kabra, M., Robie, A. A., Rivera-Alba, M., Branson, S., Branson, K. JAABA: interactive machine learning for automatic annotation of animal behavior. Nature Methods. 10 (1), 64-67 (2013).
- Donelson, N. C., et al. High-resolution positional tracking for long-term analysis of Drosophila sleep and locomotion using the "tracker" program. Plos One. 7 (5), e37250 (2012).
- Cichewicz, K., Hirsh, J. ShinyR-DAM: a program analyzing Drosophila activity, sleep and circadian rhythms. Communications Biology. 1, 25 (2018).
