热等离子体穿刺方法集成了共聚焦显微镜、光学镊子和金纳米颗粒,以研究细胞和巨型单层囊泡质膜修复过程中的蛋白质反应。该技术能够实现快速和局部的膜穿刺,从而能够识别关键蛋白质及其在复杂的质膜修复机制中的功能作用。
细胞膜对细胞存活至关重要,确保其完整性至关重要,因为细胞在其整个生命周期中都会受到损伤。为了防止膜损伤,细胞已经开发出有效的质膜修复机制。这些修复机制可以通过结合共聚焦显微镜和纳米级热等离子体来研究,以识别和研究参与活细胞和膜模型系统表面修复的关键蛋白质(如膜联蛋白)的作用。
穿刺方法采用激光在纳米颗粒辐照下诱导高度局部加热。近红外光的使用最大限度地减少了生物样品中的光毒性,而大部分吸收发生在近红外共振等离子体纳米颗粒中。这种热等离子体方法已被用于潜在的光热和生物物理研究,以通过囊泡和细胞融合研究增强对细胞内机制和细胞反应的理解。该方法已被证明是对现有膜破坏方法的补充,例如机械、化学或光学诱导的损伤,并通过造成极度局部的损伤来提供高水平的控制。损伤的程度仅限于球形纳米颗粒附近,与使用不同波长的脉冲激光相比,沿光束路径不会发生有害损伤。尽管存在某些局限性,例如纳米气泡的形成,但热等离子体方法提供了一种独特的工具,用于在不影响细胞活力的情况下,在几乎天然的环境中研究质膜修复中的细胞反应。
当与共聚焦显微镜相结合时,穿刺方法可以提供对模型膜系统中膜动力学的机理理解,以及蛋白质对膜损伤反应的定量信息,包括蛋白质募集及其生物物理功能。总体而言,将该方法应用于简化模型系统可以增强我们对活细胞中复杂的质膜修复机制的理解。
细胞膜既是物理屏障,又是信号传导平台,对细胞存活至关重要1。在整个细胞周期中,质膜 (PM) 会受到损伤,例如机械2、3、4、5 和化学6 应激诱导的损伤。为了保持膜的完整性并确保细胞存活,细胞已经开发出强大的质膜修复(PMR)机制。这些机制依赖于各种策略,例如细胞骨架重组、膜融合和膜置换策略 7,8,9,10,11,所有这些都依赖于特定蛋白质的募集。值得注意的是,膜联蛋白家族的成员已被确定为与 PMR1、9、12、13、14、15、16 过程相关的关键蛋白。PM 损伤后,细胞会经历钙离子 (Ca2+) 的涌入,这对细胞的存活构成直接威胁17。作为 PMR 策略的一部分,主要位于胞质溶胶中的膜联蛋白响应 Ca2+ 的内流,与受损质膜的内小叶结合18。膜联蛋白 A2 (ANXA2) 是与肌蛋白缺乏型肌营养不良症中 PMR 相关的膜联蛋白家族的首批成员之一,并建议通过将细胞内囊泡融合到损伤部位附近的 PM 来介导修复 5,19,20,21。随后,一些功能被归因于膜联蛋白22,它们在过去 20 年中在 PMR 中的作用引起了越来越多的关注。然而,膜联蛋白在PMR中的确切作用仍未完全清楚15,18,21,22。
本文提出了一种利用共聚焦显微镜、光镊和金纳米颗粒(AuNPs)的组合,以可控和高度局部的方式研究蛋白质-膜相互作用和膜动力学的方法。该方法可以定量研究蛋白质、脂质和小分子相互作用对膜损伤和 Ca2+ 流入的反应。尽管膜修复过程中涉及的成分复杂且多重,但模拟质膜的简化膜系统已被用于更深入地了解膜动力学和膜联蛋白对膜破坏的反应的机制 16。选择巨型单层脂质囊泡(GUV)作为具有特定脂质组成的模型膜系统。如Weinberger等人23所述,使用凝胶辅助水合方法(特别是聚乙烯醇凝胶水合)生成GUV,该方法允许将膜联蛋白有效地封装到GUV中。
利用近红外 (NIR) 激光照射对金属纳米颗粒 (NPs) 会引起 NP 的显着加热,使其成为建立生物医学应用中利用的局部热源的有效方法24.该方法最初用于在 2D 和 3D 仿生测定中直接测量单个 AuNP 周围的温度。在这些测定25,26中,等离子体纳米颗粒被照射在负载的脂质双层上,或光学捕获在局部加热时发生局部热相变的GUV附近,从而能够定量和控制颗粒周围的确切温度曲线。在研究或操作生物标本时,已使用该参考温度曲线。该方法的进一步进步促进了膜中纳米孔的诱导27,允许囊泡和细胞融合28,29。其他研究通过创建新型杂交囊泡来研究 GUVs29 和跨膜蛋白30 中外周膜蛋白的行为,同时还探索了细胞特异性药物递送来控制和研究细胞反应或基因表达28、29、31、32、33。最近,该方法已被用于研究蛋白质对膜损伤的反应32,34,35。
有几种方法可以破坏质膜以探索细胞反应和膜修复。这些包括微针穿刺、微珠摇晃和细胞刮擦,所有这些都可以机械地破坏细胞膜 14,36,37。通过添加洗涤剂 5,38 或细菌毒素39,40 可以实现化学诱导的损伤,这些洗涤剂会破坏脂质双层的稳定性并在质膜上产生膜孔。此外,连续波和脉冲激光的光学诱导损伤已被用于研究PMR组分,例如膜联蛋白5,14,21,41,与等离子体纳米颗粒42,43,44,45相结合.尽管高功率脉冲激光器效率很高,但它们可能会沿光束路径对电池内部造成重大伤害和损坏。此外,在脉冲激光照射下生物物质发生的详细变化以及它是否会产生明确的孔仍有待进一步研究。本文介绍了一种替代方法,利用热等离子体以受控方式在PM中诱导纳米孔34,35,而不会对内部结构造成重大损害。这是通过将等离子体NP暴露在高度聚焦的近红外激光下来实现的,导致极其局部的温度升高,很容易达到超过200°C的温度,这可能导致小的纳米爆炸25,46,47。该过程可以通过调整激光强度以及 NPs48 的尺寸、形状和成分来控制。通过采用这种技术,研究人员可以探索蛋白质在活细胞中PM修复中的作用,这可以帮助解决有关膜联蛋白参与膜修复的一些未解决的问题,而不会影响细胞活力。
先前的研究已经很好地确立了等离子体纳米粒子的光学捕获 25,49,50,51,52;然而,关于纳米粒子53,54,55的热等离子体性质的更多见解可以在补充材料(补充文件1)中获得。热等离子体方法可用于在PM中创建纳米孔,以研究细胞反应和修复机制。更准确地说,穿刺可以通过在膜附近对AuNPs进行光学加热来实现,如图1A和B所示。这种局部穿刺允许 Ca2+ 流入,这已通过钙传感器验证,从而激活了 PMR 机制。对于活细胞实验,将直径为 200 nm 的 AuNP 固定在细胞下方的表面上,以通过共聚焦显微镜监测 ANXA2 在 PMR 中的作用。波长为1064nm的近红外激光(图1A,B)利用其等离子体特性照射AuNP(图1C),在生物透明窗口49中产生大量的局部加热(图1D),同时对细胞本身造成最小的损害。如图1E所示,AuNP周围的高温区域在与NP半径相对应的距离处迅速减少30-40%,从而在所有三个维度上都存在极其有限的损伤。
补充文件 1. 请点击此处下载此文件。
图1:实验方法示意图。 (A) ANXA 转染的细胞位于表面固定的金纳米颗粒 (AuNP) 的顶部,或 (B) 具有封装 ANXA 的巨型单层囊泡 (GUV) 悬浮在含有 AuNP 的培养基中。(C) 单个AuNP被近红外光阱照射,其中入射电磁场和传导电子之间的相互作用导致NP内电子的集体振荡。(D)该过程导致高度限制但显着的温度升高。为了估计NP表面的温度,采用Mie理论,计算直径为200 nm,激光强度I = 6.36 x 108 W/cm2的AuNP的(E)温度分布。请点击这里查看此图的较大版本.
为了尽量减少对细胞膜的热效应,AuNPs仅被照射~1秒。这会导致瞬态和局部加热爆发,从而减少对蛋白质的损害,而蛋白质通常需要更多时间才能展开。膜穿刺后,膜联蛋白在几分之一秒内被募集,并在几秒钟内在损伤部位周围形成膜联蛋白环状支架(图2)。这种方法也被应用于探索 ANXA5 在活细胞和模型膜16 中的参与,以阐明修复过程的完整方案。虽然主要关注的是各种膜联蛋白的相关募集,但修复机制的生物物理方面尚未阐明。
为了完全实现所提出的方法,需要三个关键组件:共聚焦显微镜、光学镊子和金属纳米颗粒。光镊用于捕获AuNPs,其构造可以通过遵循Neuman等人概述的程序来实现49。然而,如果制造光学镊子被证明太具有挑战性,则可以使用紧密聚焦的近红外激光器来照射固定在细胞下方的AuNP。虽然该协议选择了球形AuNP,但也可以利用具有可调吸收光谱的各种等离子体粒子来实现NIR区域48内的高度局部温度梯度。
荧光成像对于观察荧光标记蛋白质的作用是必要的,因此,全内反射显微镜 (TIRF)56 可以被视为共聚焦成像的替代方案。然而,该技术仅允许表面成像,与模型膜囊泡实验不兼容。因此,光学镊子和共聚焦显微镜对于纳米颗粒的精确定位和细胞损伤周围局部区域的详细研究都是必不可少的。为了用衍射极限激光焦点有效地照射纳米颗粒,有必要将纳米颗粒可视化。这可以通过反射显微镜实现最佳效果,反射显微镜是徕卡共聚焦显微镜的标准成像功能。然而,如果没有反射或散射成像,可以考虑其他方法,例如效率较低的荧光AuNP标记。
综上所述,本研究提出的高度可控和局部化的热等离子体方法有可能成为研究活细胞中参与细胞反应和PM修复机制的分子成分的良好平台。除了研究 PM 损伤后的蛋白质反应外,该方法还可用于局部刺穿囊泡,从而能够研究蛋白质-蛋白质和蛋白质-膜动力学中的蛋白质反应。此外,当膜被破坏时,该方法允许对蛋白质、脂质和小分子之间的相互作用进行定量分析。总的来说,这些进展有可能揭示一些关于错综复杂的质膜修复机制的未解决的问题。
该研究强调了热等离子体方法是一种很有前途的技术,用于探索活细胞中的蛋白质反应和膜破坏后的模型膜。该方法不仅提供了有关蛋白质募集的广泛信息,还提供了有关蛋白质-膜动力学中涉及的蛋白质的生物物理功能的信息。因此,它有助于识别负责表面修复的分子成分,并促进对质膜修复复杂而重要的机制的理解。尽管存在各种诱导膜破坏的方法,例如机械、化学和光学技术,但这些方法存在局限性,例如对细胞非特异性,对细胞膜产生多次损伤,或对膜造成重大损伤,并在使用高功率脉冲激光时沿激光路径烧蚀内部细胞材料。虽然共聚焦显微镜和光镊的集成提供了最全面的信息,但也可以使用替代成像方式。例如,由于等离子体纳米颗粒的成像是使用反射显微镜实现的,徕卡共聚焦显微镜中的内置成像模式,因此可以使用其他成像技术,例如暗场显微镜65,66,其他散射方法,如iSCAT67,68或纳米颗粒的荧光标记,尽管这可能会限制该方法的适用性。
所提出的方法还能够在模型膜中诱导纳米孔,从而能够研究不同膜联蛋白之间的协同作用。这是通过封装不同标记的重组膜联蛋白(例如分别是 RFP 和 GFP)然后进行热等离子体穿刺来实现的。如 图2D所示,该模型系统提供了膜联蛋白如何与自由边缘附近的膜相互作用的见解。然而,与细胞不同的是,施加在GUV上的孔继续扩大,随后是囊泡的不稳定。由于孔直径的快速膨胀,使用共聚焦显微镜对孔的演变进行成像可能具有挑战性,但可以通过随着时间的推移捕获多个 z 堆栈来实现。另一种方法是使用旋转盘共聚焦来加快成像速度。此外,当应用于单细胞或GUV实验时,热等离子体方法通常每小时产生有限数量的最佳结果,通常为20°C至30°C之间的样品温度。 为了获得最准确的蛋白质-膜动力学观察结果,建议将细胞保存在含有HEPES的缓冲液中,并每小时更换一次样品。或者,可以通过在细胞培养室中进行实验来延长实验窗口,即在37°C的恒定温度下使用5%CO2。此外,将这种方法与其他成像技术相结合,如随机光学重建显微镜(STORM),可以在单分子水平上更深入地了解参与膜修复的关键蛋白质的生物物理功能和相互作用。这可以提供有关损伤部位的详细信息,包括伤口几何形状和膜联蛋白的位置,并确定参与修复膜表面的其他关键参与者。
为了在诱导膜损伤方面达到最大的有效性和精度,必须在每次实验之前验证激光焦点的位置,并确保激光焦点的轴向位置与共聚焦焦点重合。这种对准优化了AuNP成像过程中的强度,从而导致局部温度的最大升高,并在较低的激光功率下导致膜损伤。该过程是手动执行的,因此容易受到膜破裂效率变化的影响,因为焦点被手动转换为与颗粒位置重合的位置。在缺乏反射模式的显微镜中,如在一些商业系统中,激光焦点和粒子的共定位可能具有挑战性。在这种情况下,可以采用替代成像模式(例如,明场),并且可以在预期的粒子位置周围进行慢速光栅扫描。应该注意的是,低激光功率可能只会引起膜透化,而高激光功率会在NP周围产生超过水沸点的温度,即使玻璃表面具有冷却作用。据估计,NP周围的纳米气泡的形成发生在200°C和300°C之间25,48,其中爆炸热可能导致粒子从激光焦点位移或粒子碎裂。此外,在加热过程中纳米或微气泡的形成对这种方法提出了挑战。由于空气界面会使膜变湿并可能导致蛋白质不稳定,这是不可取的,因此在研究膜修复时必须限制加热。值得注意的是,金纳米壳不能耐受高温,并且在这些条件下会降解,如高分辨率显微镜58所示。
本文提供了使用热等离子体在膜中进行高度局部穿刺的详细方案,适用于细胞和模型膜。为了进一步降低加热程度,可以利用与近红外光共振的较小纳米颗粒,从而在内体、内质网和核膜中实现细胞内穿刺。这种纳米颗粒,包括棒状物和纳米套娃48,可用于通过靶向内吞金纳米颗粒来研究核膜修复,这些金纳米颗粒很容易在细胞表面被吸收并运输到细胞核69。总体而言,该技术能够识别和检查参与PMR的关键分子成分,阐明其生物物理功能和作用,同时保持细胞的活力。
The authors have nothing to disclose.
我们要感谢 Jesper Nylandsted 为我们提供重组膜联蛋白和编码膜联蛋白的质粒。这项工作得到了丹麦自然科学独立研究委员会(DFF-4181-00196)、诺和诺德基金会2018年跨学科协同计划(NNF18OC0034936)、丹麦癌症学会科学委员会(R90-A5847-14-S2)、灵北基金会(R218-2016-534)和灵北基金会卓越中心(纳米医学生物膜)的资助。
1064 nm trapping laser | Spectra Physics | N/A | Spectra Physics J201-BL-106C, Nd: YVO4 NIR laser |
160 nm Gold Nanoshells | NanoComposix | NCXGSIR150 | |
200 nm Gold Nanoparticles | BBI Solutions | EM.GC200/7 | |
35 mm glass surface MatTex microwell | MATTEK | P35G-1.5-14-C | |
Amber-glass vials | Supelco Sigma Aldrich | 243438 | |
Annexin A2 plasmids | N/A | N/A | Received from our collaborator at the Danish Cancer Research Center |
Annexin A4 recombinant-protein | N/A | N/A | N-terminal GFP tagged ANXA4 received from our collaborator at the Danish Cancer Research Center |
Annexin A5 recombinant-protein | N/A | N/A | N-terminal GFP tagged ANXA5 received from our collaborator at the Danish Cancer Research Center |
beta-casein | Sigma Life Science | C6905-1G | |
CaCl2 | Suprlco (sigma Aldrich) | 10035-04-8 | |
Centrifuge 5702 | Eppendorf | 5702 | |
Chloroform | VWR Chemicals | 67-66-3 | |
Culture dish (Nunclon Delta Surface) | Thermo scientific | 150460 | |
DID cell-labelling Solution | Invitrogen | 7757 | |
Distilled water | Gibco | 15230-089 | |
DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375C | Dissolved in chloroform |
DOPS | Avanti Polar Lipids | 840035C | Dissolved in chloroform |
Dulbecco's Modified Eage's Medium | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
FIJI ImageJ distribution | ImageJ2 | N/A | |
GCaMP6s-CAAX | N/A | Received from our collaborator at the Danish Cancer Research Center | |
Gibco Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 11573397 | 10% of the culture medium |
Glucose | PROLABO | 24 374.297 | |
Hamilton syringes | Hamilton Company | N/A | 50 and 500 microliters |
Harrick Plasma Cleaner PDG-002 | Harrick Plasma | N/A | |
HEK293T cells | N/A | Received from our collaborator at the Danish Cancer Research Center | |
Leica Acousto-Optical Beam Splitter (AOBS) | Leica | N/A | |
Leica PL APO 63x water immersion objective, NA = 1.2 | Leica | N/A | |
Leica SP5 confocal scanning microscope | Leica | N/A | |
Lipofectamine | Fisher Scientific | 15338030 | |
MatLab | The Mathworks, Inc., Natick, Massachusetts, United States | N/A | |
NaCl | VWR Chemicals | 7647-14-5 | |
Opti-MEM Reduced-Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | |
Parafilm | Bemis | PM-992 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 1% of the culture medium |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
Piezoelectric stage (PI 731.20) | Physik Instrumente (Germany) | N/A | |
Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich | P8920-100ML | 0.01-0.1% for coating |
Polyvinyl alcohol | Sigma-Aldrich | 363065-25G | |
round glass slide 25 mm Ø | VWR | 631-1584 | |
Sonicator Brandson 2800 | Brandson | N/A | |
sucrose | Sigma Life Science | 57-50-1 | |
T25 tissue culture flask | Falcon | 353108 | Blue Vented cap |
Tris-HCl | Invitrogen | 15567-027 | |
TrypLE | Thermo Fisher Scientific | A1285901 | |
Trypsin-EDTA | Fisher Scientific | 11590626 | |
VWR Mixer mini vortex 230V EU | VWR | 12620-84 | ECN: 444-2790, SN: 150713022 |