מודל עכבר לניאו-וסקולריזציה של הקרנית על ידי כוויה אלקלית

כל עבודת בעלי החיים, כולל הליכי הניסוי והמתת החסד, אושרה על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) במכללת ביילור לרפואה עם פרוטוקול מספר AN-8790. 1. הכנת 1 N NaOH הוסף 4 מ”ל של מים סטריליים deionized צינור צנטריפוגה 15 מ”ל. שוקלים 400 מ”ג נתרן הידרוקסידי (NaOH), ומוסיפים לצינור בזהירות. ממיסים את ה-NaOH על ידי ערבוב איטי של התמיסה באמצעות מוט זכוכית. הגדילו את הנפח ל-10 מ”ל על ידי הוספת מים סטריליים שעברו דה-יוניזציה לצינור, וערבבו שוב על ידי היפוך עדין של הצינור מעלה ומטה. סגרו היטב את המכסה ואחסנו את התמיסה בטמפרטורת החדר. הכינו את התמיסה הטרייה מדי חודש מכיוון שריכוז תמיסת NaOH עשוי להיות מופחת על ידי ספיגת פחמן דו חמצני באוויר. יש לערבב תמיד בעדינות את תמיסת NaOH לפני השימוש.אזהרה: יש להכין את התמיסה בתוך מכסה מנוע כימי וללבוש ציוד מגן אישי (PPE) מתאים. 2. הכנת תמיסת פרפורמלדהיד 4% (PFA) הוסף 30 מ”ל של 1x מלח חוצץ פוספט (PBS) לכוס זכוכית. שקלו 4 גרם של פרפורמלדהיד (PFA), והוסיפו אותו לכד. שומרים את הכד על צלחת חמה בטמפרטורה של 60°C עם ערבוב. הוסף את תמיסת 1 N NaOH טיפה כדי להעלות את ה- pH עד שהתמיסה מתבהרת. בדוק והתאם את ה- pH ל- 7.4 באמצעות 1 N חומצה הידרוכלורית (HCl). כוונן את עוצמת הקול הסופית ל- 50 מ”ל עם PBS אחד. מצננים ומסננים את הפתרון. אחסנו את התמיסה בטמפרטורה של 4°C.אזהרה: יש להכין את התמיסה במכסה אדים תוך לבישת ציוד הגנה אישי מתאים. 3. הכנת קוקטייל קטמין/קסילזין הכינו את קוקטייל הקטמין/קסילזין על ידי הוספת 0.8 מ”ל קטמין (ריכוז במלאי: 100 מ”ג/מ”ל) ו-0.16 מ”ל קסילזין (ריכוז במלאי: 100 מ”ג/מ”ל) ל-9.4 מ”ל מי מלח. אחסנו את הקוקטייל בבקבוקי הזרקה סטריליים בטמפרטורת החדר (RT). 4. שריפה אלקלית על קרנית העכבר יש להזריק מלוקסיקאם (4-6 מ”ג/ק”ג משקל גוף) תת עורית 30 דקות לפני ההליך לשיכוך כאבים. מרדימים את העכברים (C57BL/6J, גיל 6-8 שבועות, זכר) באמצעות הזרקת i.p. של קוקטייל קטמין/קסילזין (קטמין 80 מ”ג/ק”ג וקסילזין 16 מ”ג/ק”ג משקל גוף). בדוק את תגובת הרפלקס (משיכת הדוושה) על ידי צביטת אצבעות העכבר, ואשר את היעדר הרפלקס. יש למרוח טיפה אחת של חומר הרדמה מקומי, 0.5% פרופרקאין, על פני הקרנית של עין אחת, וטיפת דמעות מלאכותיות על העין השנייה. באמצעות ניקוב ביופסיה 2 מ”מ, ניקוב החוצה דיסקים נייר סינון Whatman. הוסיפו 2 μL של 1N NaOH לצלחת פטרי נקייה. הניחו את דיסק נייר הסינון בקוטר 2 מ”מ על טיפת 1 N NaOH והניחו לו להשרות למשך 15 שניות. הרימו את נייר הסינון עם מלקחיים, ומרחו את נייר הסינון על העין שטופלה בפרופרקאין במרכז הקרנית למשך 30 שניות.הערה: נייר הסינון חייב לגעת רק במרכז הקרנית, ויש להקפיד להימנע מתזוזה של נייר הסינון לאחר הנחתו, שכן הזזת נייר הסינון עלולה לגרום לכוויות ברקמות הסמוכות. לשטוף את העין על ידי שטיפה עם 20 מ”ל של תמיסת מלח סטרילית מזרק סטרילי.הערה: יש להקפיד על כך שהקרנית, יחד עם שק הלחמית, נשטפים ביסודיות כדי להבטיח שלא ייגרם נזק נוסף לקרנית או לרקמה שמסביב. שטיפת שק הלחמית תמנע עוד יותר את הסימבלפרון. נגבו את עודפי המלח בעדינות מהעיניים ומהסביבה באמצעות מגבונים רכים חד פעמיים. לאחר מכן, החזיקו את העכברים בכלוב התאוששות על כרית חימום חמה עד לאמבולטורי.הערה: עכברים מנוטרים מדי יום לאחר כוויה אלקלית במשך 3 ימים. אם הסימפטומים של כאב או מתח נצפים, meloxicam (4-6 מ”ג / ק”ג של משקל הגוף) מנוהל תת עורית. 5. בדיקה והערכה של neovascularization ואטימות בעכברים מורדמים, בדקו את העיניים תחת מיקרוסקופ דיסקציה ביום ה-10 לאחר הכוויה, וקבלו תמונות באמצעות מצלמה המחוברת לטווח הדיסקציה כדי לסקור את האטימות והניאו-וסקולריזציה.הערה: היקף דיסקציה רגיל עם מצלמה מחוברת מספיק. בעת התבוננות בקרנית דרך מיקרוסקופ דיסקציה, דרגו את האטימות לאחר הכוויה בהתבסס על סולם12 הבא:0 = ללא אטימות; קרנית שקופה1 = אטימות קלה; ערפול קל באזורי הקשתית והאישון; איריס ואישון גלויים בקלות2 = אטימות מתונה; איריס ואישון בקושי נראים3 = אטימות חמורה; קשתית או אישון אינם גלויים4 = קרנית אטומה; איריס והאישון אינם גלויים בעת התבוננות בקרנית דרך מיקרוסקופ דיסקציה, ציון CoNV מבוסס על סולםהבא 12:0 = ללא ניאו-וסקולריזציה; אין כלי שיט חדשים מהלימבוס1 = neovascularization קל; כלי שיט חדשים שמקורם בלימבוס2 = neovascularization מתון; כלי הדם מקורם בלימבוס וצומחים לכיוון מרכז הקרנית3 = neovascularization חמור; כלי דם שמקורם בלימבוס ומגיעים ו/או חוצים את מרכז הקרנית השתמש במבחן t של תלמיד כדי להשוות סטטיסטית את ציוני האטימות והניאו-וסקולריזציה בין הכוויה האלקלית לבין קבוצות עיניים בריאות. הרדימו את העכברים ביום ה-10 על ידי חשיפה לאיזופלורן ב-5% עד דקה לאחר הפסקת הנשימה, ולאחר מכן נקע צוואר הרחם, ואספו את הקרניות לצורך הדמיה שטוחה. 6. טומוגרפיה קוהרנטית אופטית (OCT) הדמיה צלם תמונות OCT של החלק הקדמי של העיניים בעכברים מורדמים ביום 10 לאחר הכוויה. בצע רכישת תמונת OCT כסריקת אמצעי אחסון באמצעות מצב IR + OCT עם שדה ראייה של 30° ועוצמת IR של 100%. כמת את עובי הקרניות באמצעות תוכנת ImageJ. למדידת העובי, השתמשו בכלי בחירת קו בתוכנת ImageJ ליצירת קו ישר בין המשטחים הקדמיים והאחוריים במרכז הקרנית. לחץ על Analyze > Measure בכלי התוכנה כדי להעביר את הערכים לחלון הנתונים. העתק את הערכים לקובץ גיליון אלקטרוני, והשווה סטטיסטית את עובי הקרנית בין הכוויה האלקלית לבין קבוצות עיניים בריאות באמצעות מבחן t של סטודנט.הערה: עובי הקרנית הוא המרחק מנקודה על פני הקרנית הקדמית לנקודה הקרובה ביותר על פני הקרנית האחורית במרכז הקרנית. 7. צביעת חיסון עבור CoNV על קרניות שטוחות הרדימו את העכברים ביום ה-10 לאחר הכוויה האלקלית, ולחנך את העיניים על ידי דיסקציה קהה. פרקו את העפעפיים בעזרת האגודל והאצבע המורה, והניחו מלקחיים מתחת לגלובוס העין. סגור את המלקחיים, ומשוך בעדינות את גלגל העין מהמסלול. מניחים את גלגלי העיניים ב-1x PBS. עבור כל גלגל עין, להסיר את הקרנית מגלובוס העין על ידי ביצוע חתך תחילה באמצעות מחט 30 G מתחת לאזור הלימבוס. חותכים סביב אזור הלימבוס באמצעות מספריים מיקרו של הקרנית, עם החתך כנקודת ההתחלה, ומפרידים לאט לאט את הקרנית והלימבוס מהגלובוס. נקו את הקרניות בעדינות בעזרת מברשת צבע עדינה להסרת הקשתית. תקן את הקרניות ב 4% paraformaldehyde במשך 1 שעות. שטפו את הקרניות שלוש פעמים במשך 20 דקות כל אחת ב-1x PBS בטמפרטורת החדר (RT). יש לדגור במאגר חוסם (1x PBS בתוספת 0.1% Triton-X 100 ו-5% אלבומין בסרום בקר [BSA]) למשך שעה אחת ב-RT. מעבירים את הקרניות לתמיסת נוגדנים המכילה נוגדנים ראשוניים. הכינו את תמיסת הנוגדנים ב-1x PBS בתוספת 1% BSA, 0.1% Triton-X 100, Dylight550-conjugated anti-CD31 mAb (1:100) ו-Alexa Fluor488-conjugated anti-LYVE-1 mAb (1:100). לדגור במשך 3 ימים ב 4 °C (75 °F). לשטוף את הקרניות ב 1x PBS שלוש פעמים במשך 20 דקות כל אחד. הכתימו את הגרעינים באמצעות תמיסת כתמים Hoechst (1:1,000) למשך 5 דקות בחושך. משטחים את הקרניות בחתכים רדיאליים, ומרכיבים אותן על מגלשת זכוכית מנוקה מראש באמצעות אמצעי הרכבה וכיסויים. אטמו את הכיסויים בלק שקוף, וייבשו את המגלשות למשך הלילה בחושך לפני הניתוח במיקרוסקופ קונפוקלי. דמיינו את הקרניות השטוחות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי על ידי תפירת תמונות בודדות של ערימת Z; השתמש בלייזר אובייקטיבי של 10x, 488 ננומטר ו- 561 ננומטר, ורזולוציה של 512 פיקסלים x 512 פיקסלים לפרוסה בסורקי Galvano שאינם בעלי תהודה. כמת את צפיפות כלי הדם CD31+ וכלי הלימפה LYVE-1+ באמצעות תוכנת ImageJ. לקביעת צפיפות כלי הדם, המירו את התמונות הקונפוקליות לתמונה של 8 סיביות. בחר צפיפות כלי דם מהתוספים. בחר את אזור העניין בתמונה ולחץ על אישור. המדידות ייפתחו בחלון נתונים חדש. העתק את הערכים לקובץ גיליון אלקטרוני, והשווה סטטיסטית את צפיפות כלי הדם בין הכוויה האלקלית לבין קבוצות עיניים בריאות באמצעות מבחן t של סטודנט.הערה: CD31, המכונה גם מולקולת הידבקות תאי אנדותל טסיות דם-1 (PECAM-1), היא מולקולת היצמדות תאים המעורבת באנגיוגנזה ומתבטאת מאוד בתאי אנדותל של כלי דם מוקדמים ובשלים13. LYVE-1 (Lymphatic vessel endothelial hyaluthelial hyaluronan receptor-1) הוא סמן פני התא על תאי אנדותל לימפטיים ויכול לשמש כסמן לימפנגיוגנזה14.