Imágenes de inmunofluorescencia de trampas extracelulares de neutrófilos en tejidos humanos y de ratón

Las trampas extracelulares de neutrófilos (TNE) fueron visualizadas por primera vez por Brinkmann et al. como una vía de muerte celular diferente de la apoptosis y la necrosis en 2004¹. En esta vía, los neutrófilos liberan su cromatina descondensada en el espacio extracelular para formar grandes estructuras en forma de red cubiertas de proteínas antimicrobianas que antes se almacenaban en los gránulos o en el citosol. Estas proteínas antimicrobianas incluyen la elastasa de neutrófilos (NE), la mieloperoxidasa (MPO) y la histona citrulinada H3 (H3cit), que se utilizan comúnmente para la detección indirecta por inmunofluorescencia de los TNE². Este método no solo identifica la presencia cuantitativa de estas proteínas; de hecho, tiene la ventaja de detectar específicamente estructuras similares a NET. En los NETs, las proteínas mencionadas se colocalizan con el ADN extracelular, que puede ser detectado por una superposición de las señales de fluorescencia de cada proteína teñida y el ADN extracelular. A diferencia de las señales superpuestas debidas a la colocalización extracelular de ADN y proteínas en los TNE, los neutrófilos intactos no muestran colocalización. Aquí, los componentes del NET generalmente se almacenan por separado en los gránulos, los núcleos y el citosol³.

Desde su primer descubrimiento, se ha demostrado que los TNE desempeñan un papel central en numerosas enfermedades, especialmente en las que implican inflamación. Los TNE muestran funciones antimicrobianas durante la infección al atrapar y matar patógenos extracelulares en sangre y tejidos ^4,5. Sin embargo, los TNE también se han relacionado con enfermedades autoinmunes y respuestas hiperinflamatorias, como el lupus eritematoso sistémico, la artritis reumática y el asma alérgica ^6,7,8. Los TNE promueven la vaso-oclusión y la inflamación en la aterosclerosis, la adhesión plaquetaria y se especula que desempeñan un papel en el cáncer metastásico 9,10,11. Sin embargo, se cree que tienen propiedades antiinflamatorias al reducir los niveles de citoquinas proinflamatorias¹². Si bien los NET están ganando más interés en un campo de investigación más amplio, un método robusto de detección de NET es fundamental para futuras investigaciones.

A pesar de que la visualización de los TNE en diferentes tejidos mediante imágenes de inmunofluorescencia es compleja y requiere personalización, además de la microscopía electrónica, actualmente es uno de los métodos más reconocidos para visualizar las interacciones entre los TNE y las células y se utiliza predominantemente en tejidos fijados en formol e incluidos en parafina (FFPE)^13,14. Sin embargo, la comparación de las imágenes NET es difícil, ya que los diferentes laboratorios utilizan sus propios protocolos personalizados. Estos protocolos difieren en el uso de anticuerpos, la recuperación de antígenos o el método de permeabilización y, a menudo, están optimizados para un tipo específico de tejido 3,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 ^,27.

Después de que Brinkmann et al. publicaran el primer estudio metódico utilizando la visualización inmunofluorescente de NETs en tejido FFPE, quisimos optimizar este protocolo para una variedad más amplia de tejidos y especies¹⁵. Además, para establecer un protocolo de inmunofluorescencia ampliamente aplicable, probamos diferentes protocolos modificados de estudios que utilizaron métodos de inmunofluorescencia en tejido FFPE para detectar NETs 3,13,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25^{, 26,27}. Además, probamos un nuevo anticuerpo H3cit para una tinción extracelular más específica²⁸. Nuestra hipótesis es que mediante la adaptación sistemática de los protocolos de tinción actuales a diferentes especies y tejidos, se pueden mejorar las imágenes in vitro, lo que resulta en una mejor representación de la interacción entre los neutrófilos y los NET tanto a nivel local como sistémico.