Glioblastoom Relapse Post-Resection Model voor therapeutisch hydrogel onderzoek

Alle dierproeven werden goedgekeurd en gecontroleerd door de Institutional Review Board en de Animal Ethics Committee van Nanjing Medical University (IACUC-1904004). C57BL/6J vrouwelijke muizen, in de leeftijd van 6-8 weken oud, werden gebruikt voor de huidige studie. De dieren werden verkregen uit een commerciële bron (zie tabel met materialen). 1. Voorbereiding van dieren Weeg de muizen en verdoof ze met een intraperitoneale injectie van 50 mg/kg pentobarbitalnatrium (zie materiaaltabel). Dien meloxicam (5 mg / kg; i.p.) toe voor perioperatieve analgesie. Plaats de muizen in een kooi onder een licht/donkercyclus van 12 uur/12 uur, een omgevingstemperatuur van 24 °C en een relatieve vochtigheid van 50%.OPMERKING: Voor de huidige studie was het oorspronkelijke gewicht van de muizen ongeveer 22 g. Verwijder het haar op het hoofd van een muis met behulp van een scheerapparaat van een proefdier en bevestig het hoofd en de ledematen op het stereotaxische apparaat (zie tabel met materialen).OPMERKING: Steriliseer alle apparatuur voor gebruik. Desinfecteer de kop van de muis met ten minste drie afwisselende rondes chloorhexidine of povidon-jodiumscrub gevolgd door alcohol en bedek de muis met een steriel chirurgisch gordijn. Breng oogheelkundige zalf aan op beide ogen om uitdroging te voorkomen. Knip de hoofdhuid van de muis ongeveer 1 cm langs de middellijn op de bovenkant van het rechter voorhoofd met een oogheelkundige schaar.OPMERKING: Bevestig het chirurgische gebied van anesthesie door de afwezigheid van pedaalreflex voordat u de incisie maakt. Stem het stereotaxische apparaat af om ervoor te zorgen dat de visgraatnaad en het voorste fontanelpunt zich op hetzelfde niveau bevinden. 2. Constructie van het orthotopische intracraniële GBM-model Markeer het punt 1 mm aan de voorkant van de voorste fontanel, 1,8 mm aan de rechterkant van de voorste fontanel en 3 mm naar beneden vanaf de voorste fontanel met behulp van een wattenstaafje gedoopt met gentiaanviolet2 (zie materiaaltabel). Boor de punt met behulp van een mini-schedelboor met een diameter van 1 mm (zie materiaaltabel) om een poriegrootte van ongeveer 1 mm diameter en 1 mm diepte te creëren. Verwijder het uitgestoten hersenvocht met een steriel wattenstaafje. Zuig 5 μL tumorcelsuspensie (GL261-Luci, 5 × 10 5 cellen gesuspendeerd in5 μL PBS) met een microsyringe.OPMERKING: De GL261-Luci is verkregen uit een commerciële bron (zie Materiaaltabel). Lijn de naaldpunt van de microsyring verticaal uit met het schedelboorgat, breng in totdat de naaldpunt 3 mm in het schedelvlak komt en breng de naald 0,5 mm terug7. Open de microspuit en injecteer met een snelheid van 1 μL/min. Houd de naald 10 minuten na injectie vast. Trek de microsyringe langzaam terug en druk met een steriel droog watje op het injectiepunt. Hecht de hoofdhuid met een niet-absorbeerbare chirurgische hechting (10-0, zie tabel met materialen) en desinfecteer de incisie opnieuw. Controleer de gezondheid van het dier en houd het in warme omstandigheden. Beweeg de muis terug naar de behuizingskooi nadat de muis wakker is geworden. Stel de muis voor met een in vivo bioluminescent beeldvormingssysteem (zie tabel met materialen) om de getransplanteerde tumor te detecteren op de 10e dag na tumordragendheid.OPMERKING: Luciferase geladen in de GBM-cellen, GL261, werd gebruikt voor de bioluminescente beeldvorming.Verdoof de muis met 1,5% isofluraan met een zuurstofdebiet van 0,6L/min. Na bevestiging van de anesthesiediepte via een gebrek aan pedaalreflex, injecteert u de muis intraperitoneaal met kaliumfluoresceïne (10 mg / ml, zie materiaaltabel) en voert u 11 s later de in vivo bioluminescente beeldvorming uit. Wanneer de fluorescentiewaarde ~ 5 × 105 bereikt, is de procedure succesvol.OPMERKING: Verdoof het dier voordat u het in beeld brengt. Handhaaf anesthesie via neuskegel geleverd met verdampt isofluraan. Selecteer de muizen met succesvolle tumordragende om het GBM-terugvalpost-resectiemodel te construeren. 3. Constructie van het GBM relapse post-resection model Wanneer de tumorgrootte in de orthotopische intracraniële GBM-modelmuizen ~6,5 × 105 wordt, selecteert u de muizen voor het postoperatieve terugvalmodel. Weeg de orthotopische intracraniële GBM-modelmuizen en verdoof de muizen met een intraperitoneale injectie van 50 mg / kg pentobarbitalnatrium. Dien meloxicam (5 mg / kg; i.p.) toe voor perioperatieve analgesie. Herhaal het proces van stap 1.2−1.5. Scheid het hoofdhuidweefsel en de schedel en controleer het boorgat dat is gebruikt om het orthotopische intracraniële GBM-model te bouwen. Als het gat is genezen, identificeert u het gat met behulp van stereotactisch apparaat en volgt u de procedure die wordt vermeld in stappen 2.1-2.3. Breid de diameter van het gat uit tot 5 mm met een schedelboor en verwijder het uitgestoten hersenvocht met een steriel wattenstaafje. Richt de microscoop op de kop van de muis en pas de instellingen aan om ervoor te zorgen dat het boorgat zich in het midden van het gezichtsveld bevindt. Knip de hersenvliezen met een microschaar en verwijder een deel van het tumorweefsel met een microcurette en een micro-scalpel onder de microscoop.OPMERKING: Met betrekking tot de hersenvliezen, wanneer de schedel wordt geopend, is het dunne membraan dicht bij het hersenweefsel de hersenvliezen. Stop het bloeden met steriel gaas en was de incisie met steriele fysiologische zoutoplossing. Injecteer de in de handel verkrijgbare hydrogel (10 μl, zie materiaaltabel) in de resectieholte met een spuit van 1 ml, hecht de hoofdhuid met een niet-absorbeerbare chirurgische hechting (10-0) en desinfecteer de incisie opnieuw (figuur 1). Controleer de gezondheid van het dier en houd de muis warm. Beweeg de muis terug naar de behuizingskooi nadat de muis wakker is geworden. Voer in vivo bioluminescente beeldvorming uit om de getransplanteerde tumor 1 dag later te detecteren om de grootte van de resterende tumor te kwantificeren (figuur 2 en figuur 3). Weeg de muizen elke 2 dagen tot het eindpunt.OPMERKING: Voor de huidige studie was het terminale eindpunt dag 30 en werden de muizen geëuthanaseerd door een overdosis pentobarbitalnatrium met een intraperitoneale injectie.