Un stock congelado de neuronas listo para usar es una herramienta poderosa para evaluar las funciones sinápticas. Aquí, introducimos un cultivo primario fácil de baja densidad a partir de material congelado utilizando una placa de 96 pocillos.
El cultivo neuronal es un sistema valioso para evaluar las funciones sinápticas y los exámenes de detección de fármacos. En particular, un cultivo de baja densidad de neuronas primarias del hipocampo permite el estudio de neuronas individuales o componentes subcelulares. Hemos demostrado la localización de proteínas subcelulares dentro de una neurona mediante inmunocitoquímica, polaridad neuronal, morfología sináptica y su cambio en el desarrollo utilizando un cultivo primario del hipocampo de baja densidad. Recientemente, las reservas congeladas de neuronas listas para usar se han vuelto comercialmente disponibles. Estas reservas congeladas de neuronas reducen el tiempo necesario para preparar experimentos con animales y también contribuyen a la reducción del número de animales utilizados. Aquí, introducimos un método de cultivo primario de baja densidad reproducible utilizando una placa de 96 pocillos. Utilizamos un stock congelado comercialmente disponible de neuronas del hipocampo embrionario de rata. Las neuronas se pueden cultivar de manera estable a largo plazo sin cambios en los medios al reducir el crecimiento de células gliales en puntos de tiempo particulares. Este ensayo de alto rendimiento que utiliza cultivo de baja densidad permite evaluaciones reproducibles basadas en imágenes de la plasticidad sináptica.
El desarrollo de un sistema experimental in vitro que pueda evaluar las funciones sinápticas involucradas en el aprendizaje y la memoria es importante. El cultivo neuronal es un sistema valioso para evaluar las funciones sinápticas in vitro. La técnica de cultivo neuronal se utilizó por primera vez en la década de 1980, y en la década de 1990, se desarrolló un cultivo de baja densidad de neuronas primarias del hipocampo 1,2,3 para el estudio de neuronas individuales en términos de localización subcelular de componentes proteicos, tráfico de proteínas, polaridad neuronal, morfología de la columna vertebral, desarrollo de sinapsis y plasticidad 4,5,6,7,8 . Sin embargo, hay muchos pasos involucrados en esta técnica: apareamiento de animales, disección de embriones, preparación de vasos de cultivo y cultivo de células durante 3 semanas con cambios de medios una vez a la semana. Además, requiere técnicas avanzadas3.
Hemos desarrollado reservas congeladas de neuronas disociadas del hipocampo a partir de embriones de rata 9,10. Las reservas congeladas de neuronas están listas para usar, y no se requieren técnicas avanzadas para cultivar las células11,12. En otras palabras, cultivar las neuronas a partir de existencias congeladas no depende de la técnica de un experimentador. Elimina la necesidad de experimentos con animales (por ejemplo, permiso para experimentos con animales, organización de animales preñados cronometrados y disección de embriones de rata), reduciendo así el número de animales utilizados. Recientemente, las reservas congeladas de neuronas de alta calidad y listas para usar se han vuelto comercialmente disponibles. Aquí, utilizamos existencias congeladas disponibles comercialmente del hipocampo de rata embrionario (E)18 13,14,15. El cultivo de las neuronas a partir de un material congelado no requiere medios acondicionados por la glía o cocultivo con células gliales. Se pueden utilizar medios de cultivo primarios ordinarios sin suero adicional para cultivar las células; por lo tanto, podemos adquirir datos reproducibles. Además, no hay necesidad de intercambio de medios durante 3 semanas después de la siembra celular ya que se reduce el crecimiento de las células gliales (Figura 1).
Las espinas dendríticas son el compartimiento postsináptico de la mayoría de las sinapsis excitatorias. Contienen proteínas receptoras, proteínas de andamio postsináptico y proteínas citoesqueléticas de actina. Nos centramos en una proteína de unión a actinadrebrina 5,6,7,16,17,18. La drebrina se acumula en la cabeza de la columna vertebral en las neuronas maduras19, y reportamos drebrina como marcador del estado sináptico 15,17,20,21,22,23. Al realizar un análisis de alto contenido utilizando drebrina como lectura, hemos reportado recientemente los efectos inhibitorios de los análogos de fenciclidina sobre los receptores de glutamato tipo ácido N-metil-D-aspártico (NMDARs)10 y los efectos dependientes de NMDAR de compuestos naturales y drogas crudas en estados sinápticos15.
Aquí, detallamos cómo cultivar reservas congeladas de neuronas a baja densidad. Además, mostramos una evaluación basada en imágenes de drebrina del estado sináptico utilizando placas de 96 pocillos.
Un paso crítico en este método es descongelar la suspensión celular. La transferencia de la suspensión celular antes de que se caliente demasiado es muy importante. Sin embargo, para evitar el cambio rápido de osmolalidad, no transfiera la suspensión celular a un gran volumen del medio a la vez. La adición gota a gota del medio de cultivo también es crucial para evitar cambios repentinos en la presión osmótica.
Las neuronas se pueden cultivar en otros vasos de cultivo: placas de 24 pocillos, cámaras de 8 pocillos, platos de 60 mm o sondas MED. En esos casos, sin embargo, la concentración final y el momento de la adición de Ara-C deben ajustarse. Además, la densidad de las neuronas necesita ser optimizada en diferentes tipos de experimentos. Por ejemplo, se requiere un cultivo de alta densidad para experimentos electrofisiológicos, y en ese caso, se necesita el intercambio de medios dos veces por semana (Figura 6). Por lo tanto, una cultura de baja densidad requiere menos pasos que una cultura de alta densidad.
El cultivo neuronal de baja densidad a menudo requiere técnicas avanzadas; Sin embargo, el uso de material congelado listo para usar resuelve este problema. El método descrito no depende de la habilidad de un experimentador. La calidad del material congelado es estable y se puede cultivar de forma estable siempre que se almacenen en nitrógeno líquido y eviten cambios de temperatura hasta por 4 años.
El cultivo de las células durante 3 semanas sin intercambio de medios plantea la cuestión de si hay cambios significativos en la osmolalidad o evaporación de los medios de cultivo. Sin embargo, hemos confirmado que la evaporación de los medios de cultivo es pequeña (tasa de reducción del 3,6%). La localización de las proteínas sinápticas y la morfología de las neuronas parecen normales después de 3 semanas. Por lo tanto, el cultivo de 3 semanas sin intercambio de medios no causa grandes cambios de osmolalidad que afecten las condiciones de las neuronas cultivadas. Mantener la placa en una incubadora después del tratamiento Ara-C también es un punto importante que minimiza la evaporación.
No hay limitación con respecto al uso de las neuronas de stock congeladas. Sin embargo, existen algunas limitaciones del método de cultivo de baja densidad. Confirmamos que el cultivo de baja densidad podría aplicarse para la observación morfológica de neuronas, la evaluación de la función sináptica y la transfección de GFP. Sin embargo, no hemos examinado las imágenes de células vivas. Además, como se mencionó anteriormente, se requiere un cultivo de alta densidad para realizar electrofisiología.
La maduración de la sinapsis suele tardar 3 semanas7, y no podemos confirmar que las neuronas cultivadas tengan sinapsis adecuadas hasta el final. Si la maduración de la sinapsis no es buena después de 3 semanas, tendríamos que volver a cultivar. Al conocer la calidad de las neuronas antes de comenzar los experimentos, podemos ahorrar estas 3 semanas. Por lo tanto, para realizar experimentos de manera eficiente, es mejor verificar la calidad de las neuronas con anticipación. Las existencias congeladas permiten verificar la calidad de las neuronas de antemano. Cada lote de existencias congeladas se genera a partir de una camada de ratas, y podemos utilizar una de las existencias de cada lote para un control de calidad. La drebrina es un buen marcador para el control de calidad de las neuronas. Como se ha descrito, la drebrina se acumula en la cabeza de la columna vertebral en las neuronas maduras y reacciona a la estimulación sináptica. Por lo tanto, podemos verificar la calidad de las neuronas en las existencias congeladas utilizando drebrina como marcador.
Este método se puede aplicar para evaluar el efecto de los fármacos en el estado sináptico. El éxodo de drebrina de las espinas dendríticas ocurre durante las etapas iniciales de la plasticidad sináptica22. Por lo tanto, la detección de la reducción del grupo de drebrina provocada por el tratamiento farmacológico muestra que el fármaco estimula la sinapsis y causa plasticidad sináptica. Además, para identificar si la reducción es dependiente de NMDAR, es útil un experimento con ácido 2-amino-5-fosfonovalérico (APV, un antagonista de NMDAR). Usando drebrin como marcador, incluso una dependencia NMDAR está claramente determinada10,15. El método descrito es útil en exámenes de detección de fármacos, estudios farmacológicos de seguridad y evaluación de la función sináptica.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a Kazumi Kamiyama y Manami Kawada por su ayuda con los experimentos. Este trabajo fue apoyado por JSPS KAKENHI (Número de subvención 19K08010 a N.K.) y la Agencia Japonesa para la Investigación y el Desarrollo Médico (AMED) (Número de subvención JP19bk0104077 y JP22bm0804024 a T.S.).
96 well plate | Zeon Corporation | Gifted | |
96 well plate | greiner | 655986 | |
Anti-drebrin antibody (M2F6) | MBL | D029-3 | Mouse monoclonal (dilution 1:1) |
Anti-MAP2 antibody | Millipore | AB5622 | Rabbit (dilution 1:1000) |
Anti-mouse Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A11031 | Dilution 1: 500 |
Anti-rabbit Alexa Fluor | Thermo Fisher Scientific | A11008 | Dilution 1: 500 |
B-27 | Gibco | 17504-044 | 2 v/v% for MEA plates; 50x for normal plates |
Borax | Sigma | B-9876 | Final concentration 12 mM |
Boric acid | WAKO | 021-02195 | Final concentration 50 mM |
Bovine serum albumin | Millipore | 12659-100G | Final concentration: 3% in PBS |
Confocal quantitative image cytometer CellVoyager CQ1 |
YOKOGAWA | Phase contrast images | |
Cytosine β-D-arabino-furanoside (Ara-C) | Sigma | C-6645 | Diluted in dH2O (final concentration: 0.2 µM) |
DAPI | FUJIFILM | 340-07971 | Dilution 1:1000 |
GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 2.5 mM for MEA plates; 400x for normal plates |
In Cell Analyzer 2200 | Cytiva | Fluorescence images | |
Laminin | Sigma | 114956-81-9 | Final concentration: 20 µg/mL |
Maestro | Axion Biosystems | MEA recordings | |
MEA plate | Axion Biosystems | M768-tMEA-48W | |
Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
Paraformaldehyde | nacalai tesque | 26126-25 | Final concentration: 4% in PBS |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100 U/mL for normal plates |
Penicillin/Streptomycin | nacalai tesque | 26253-84 | 100 µg/mL for MEA plates |
polyethyleimine | Sigma | 9002-98-6 | Final concentration: 0.1% |
Poly-L-lysine | Sigma | P2636 | Diluted in the borate buffer (final concentration: 1 mg/mL) |
SKY Neuron | AlzMed , Inc. | ARH001 | 1.0 x 106 cells/tube |
Sodium azide | FUJIFILM | 195-11092 | 0.1% |
SodiumL(+)-Glutamate monohydrate | WAKO | 194-02032 | Diluted in dH2O (final concentrations: 1 µM, 3 µM, 10 µM, 30 µM, 100 µM) |