Une méthode de culture 3D de sphéroïdes de lignées cellulaires de poissons-zèbres embryonnaires et hépatiques
Summary
Ici, nous présentons un protocole de culture 3D efficace, facile et rapide pour la formation de sphéroïdes de deux lignées cellulaires de poisson zèbre (Danio rerio): ZEM2S (embryon) et ZFL (hépatocytes normaux).
Abstract
Les lignées cellulaires de poissons sont des modèles in vitro prometteurs pour l’évaluation de l’écotoxicité; cependant, les systèmes de culture monocouche conventionnels (culture 2D) ont des limites bien connues (p. ex. longévité de la culture et maintien de certaines fonctions cellulaires in vivo ). Ainsi, des cultures 3D, telles que des sphéroïdes, ont été proposées, car ces modèles peuvent reproduire des structures tissulaires, mieux recapturer les conditions in vivo . Cet article décrit un protocole de culture 3D efficace, facile et rapide pour la formation de sphéroïdes avec deux lignées cellulaires de poisson zèbre (Danio rerio) : ZEM2S (embryon) et ZFL (hépatocytes normaux). Le protocole consiste à plaquer les cellules dans une plaque à fond rond, à fixation ultra-basse, à 96 puits. Après 5 jours sous agitation orbitale (70 rpm), un seul sphéroïde par puits est formé. Les sphéroïdes formés présentent une taille et une forme stables, et cette méthode évite la formation de plusieurs sphéroïdes dans un puits; Ainsi, il n’est pas nécessaire de choisir à la main des sphéroïdes de tailles similaires. La facilité, la rapidité et la reproductibilité de cette méthode sphéroïde la rendent utile pour les tests in vitro à haut débit.
Introduction
Les sphéroïdes sont de petites sphères de cellules formées lorsque les cellules sont cultivées en contact étroit de cellule à cellule en culture 3D. La capacité des sphéroïdes à imiter l’environnement tissulaire in vivo a déjà été étudiée dans une variété de lignées cellulaires et de cellules primaires 1,2. Cependant, bien que les sphéroïdes soient bien développés pour les études de toxicité chez les mammifères, le développement de sphéroïdes pour les études de toxicité avec des vertébrés non mammifères (p. ex. poissons) est toujours en cours3. Pour les lignées cellulaires de poissons, les sphéroïdes ont été développés par une variété de méthodes différentes, telles que l’agitation orbitale (OS) en utilisant différents types de plaques de puits 3,4,5,6,7, et la méthode de lévitation magnétique utilisant des nanoparticules magnétiques8. Cependant, certaines de ces méthodes de culture pour les sphéroïdes peuvent avoir plus d’inconvénients que d’autres.
Par exemple, les méthodes giratoires dans de grandes microplaques (plaques à 24 puits) peuvent générer un nombre élevé de sphéroïdes de taille et de forme différentes; En effet, la formation de structures multi-sphéroïdes a été démontrée7. Cela nécessite des efforts intenses pour sélectionner des sphéroïdes de taille et de forme similaires pour une expérience. La méthode de culture 3D à gouttes suspendues est couramment utilisée pour générer des sphéroïdes de lignées cellulaires de mammifères 1,2,9,10,11, ce qui permet de générer des sphéroïdes uniques par goutte, évitant ainsi les problèmes décrits ci-dessus. Cependant, bien qu’une méthode de goutte suspendue modifiée (goutte suspendue + secousse orbitale) soit capable de générer des sphéroïdes ZFL en utilisant une méthode peu coûteuse, elle présente ses inconvénients12. Les agrégats cellulaires formés ne peuvent pas être maintenus pendant de longues périodes dans les gouttes; Ainsi, ils doivent être transférés sur des plaques de puits. Ce processus nécessite une manipulation intense et de longues périodes de travail dans une hotte à flux laminaire, car il est effectué goutte à goutte à l’aide d’une micropipette12. De plus, cette méthode nécessite 10 jours pour former complètement les sphéroïdes ZFL (5 jours en goutte suspendue + 5 jours en SG)12. Ces inconvénients peuvent limiter l’application de sphéroïdes de poissons 3D pour les tests de toxicité, en particulier compte tenu des applications potentielles pour la priorisation des produits chimiques et la durabilité des produits.
Ainsi, cet article décrit un protocole de culture 3D capable de générer des sphéroïdes uniques de lignées cellulaires ZFL (hépatocytes normaux de D. rerio) et ZEM2S (embryon en phase blastula de D. rerio) basés sur l’utilisation combinée de plaques de fixation ultra-basses à 96 puits (plaques ULA) et d’un agitateur orbital (diamètre de rotation de 22 mm). La méthode appliquée est simple et reproductible, et peut générer un grand nombre de sphéroïdes de taille et de forme similaires en peu de temps (5 jours). Les avantages de cette méthode peuvent soutenir l’application de modèles 3D de poissons pour les études de toxicité aquatique dans l’industrie et le milieu universitaire, ainsi que les progrès de la mise en œuvre de méthodes alternatives pour les essais d’écotoxicité.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il s’agit d’une méthode simple, facile et rapide pour générer des sphéroïdes de lignées cellulaires de foie et d’embryons de poisson zèbre. Cette méthode a été développée par ce groupe sur la base des modifications apportées aux méthodes sphéroïdes 3D existantes pour surmonter les problèmes signalés dans les études scientifiques liées à la formation de sphéroïdes, ainsi que les incertitudes dans la précision des données des tests 3D sphéroïdes. Par exemple, les problèmes signalés résid…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
En mémoire du Dr Márcio Lorencini, coauteur de cet ouvrage, excellent chercheur dans le domaine des cosmétiques et dévoué à la promotion de la recherche cosmétique au Brésil. Les auteurs remercient le Laboratoire multi-utilisateurs du Département de physiologie (UFPR) pour la disponibilité des équipements et pour le soutien financier de la Coordination pour l’amélioration du personnel de l’enseignement supérieur (CAPES, Brésil) (Code financier 001) et du Grupo Boticário.
Materials
| 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate, Individually Wrapped, with Lid, Sterile | Corning | 7007 | |
| DMEM, powder, high glucose, pyruvate | Gibco | 12800-017 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix, powder | Gibco | 21700026 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630080 | |
| Image Processing and analysis in Java (ImageJ) 1.52p software | National Institutes of Health, USA |
Available at: https://imagej.nih.gov/ij/index.html | |
| Leibovitz's L-15 Medium, powder | Gibco | 41300021 | |
| Orbital shaker | Warmnest | KLD-350-BI | 22 mm rotation diameter |
| Dulbeccos PBS (10x) with calcium and magnesium | Invitrogen | 14080055 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 31800-014 | |
| FBS – Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | Gibco | 12657-029 | |
| Sodium bicarbonate, powder, bioreagent for molecular biology | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Trypan blue stain (0,4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Gibco | 15400054 | |
| ZEM2S cell line | ATCC | CRL-2147 | This cell line was kindly donated by Professor Dr. Michael J. Carvan (University of Wisconsin, Milwaukee, USA) |
| ZFL cell line | BCRJ | 256 |
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