HPLC gekoppelt mit chemischem Fingerabdruck zur Multimustererkennung zur Identifizierung der Authentizität von Clematidis armandii caulis
Summary
Hier stellen wir ein Protokoll zur Etablierung der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) in Verbindung mit der Multimustererkennung des chemischen Fingerabdrucks vor, das eine neue Strategie zur effektiven Identifizierung der echten Sorten von Clematidis Armandii Caulis und seiner Verfälschungsmittel bietet.
Abstract
Eine Methode zur Identifizierung chinesischer Arzneimittel und ihrer verwandten Verfälschungsmittel wurde am Beispiel von Clematidis Armandii Caulis (Chuanmutong, einer universell verwendeten traditionellen chinesischen Medizin) entwickelt. Zehn Chargen echter Chuanmutong-Sorten und fünf Chargen verwandter Verfälschungsmittel wurden analysiert und verglichen, basierend auf den Fingerabdrücken der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) in Kombination mit Chemometrie, einschließlich Clusteranalyse (CA), Hauptkomponentenanalyse (PCA) und orthogonaler partieller Diskriminierungsanalyse der kleinsten Quadrate (OPLS-DA). Zusätzlich wurde der Gehalt an β-Sitosterol bestimmt. Der chemische Kontrollfingerabdruck von Chuanmutong wurde ermittelt und 12 gemeinsame Spitzen identifiziert. Die Ähnlichkeit zwischen dem Fingerabdruck von 10 Chargen echter Chuanmutong-Sorten und dem Kontrollfingerabdruck betrug 0,910-0,989, während die Ähnlichkeit von fünf Chargen von Verfälschungsmitteln nur 0,133-0,720 betrug. Basierend auf den gemeinsamen Peaks im Chromatogramm wurden 15 Probenchargen von PCA in drei Gehaltsstufen eingeteilt und von CA in vier Kategorien aggregiert, wodurch eine klare Unterscheidung zwischen authentischem Chuanmutong und Verfälschungsmitteln von Chuanmutong erreicht wurde. Darüber hinaus wurden sieben differentielle Komponenten, die authentisches Chuanmutong und Verfälschungsmittel von Chuanmutong effektiv identifizieren können, durch OPLS-DA gefunden. Der β-Sitosterin-Gehalt von 10 Chargen echter Chuanmutong-Sorten betrug 97,53-161,56 μg/g, während der β-Sitosterin-Gehalt der fünf Chargen von Verfälschungsmitteln stark variierte, darunter der β-Sitosterin-Gehalt von Clematis peterae Hand.-Mazz. und Clematis gouriana Roxb. Var. finetii Rehd. et Wils. war deutlich niedriger als die authentischen Sorten von Chuanmutong. Der Inhalt der HPLC-Indexkomponente und die in dieser Studie etablierte Methode zur Erkennung chemischer Fingerabdrücke mit mehreren Mustern bieten eine neue Strategie zur effektiven Identifizierung authentischer chinesischer Arzneimittel und verwandter Verfälschungsmittel.
Introduction
Chuanmutong, trockener Caulis von Clematis armandii Franch. oder Clematis montana Buch.-Ham., ist eine traditionelle chinesische Medizin, die häufig in den Kliniken 1,2,3 verwendet wird. Es wird zur Behandlung von Harnproblemen, Ödemen, Wunden an Zunge und Mund, verminderter Milchsekretion, Gelenksteifigkeit und Muskelschmerzen durch feuchte Hitze verwendet4. Chuanmutong wurde schon immer aus wilden Sorten gewonnen, die hauptsächlich im Südwesten Chinas verbreitet sind, insbesondere in Sichuan, wo die beste Qualität zu finden ist 5,6. Es ist schwierig, zwischen authentischen Sorten und ihren eng verwandten Verfälschungsmitteln zu unterscheiden, da sie ähnliche Eigenschaften 7,8,9,10 aufweisen. Der Qualitätsstandard von Chuanmutong in der Ausgabe 2020 des chinesischen Arzneibuchs legt nur die Eigenschaften, die mikroskopische Identifizierung und die Dünnschichtidentifizierung ohne Inhaltsbestimmung fest, die Verfälschungsmittel nicht effektiv identifizieren können und daher potenzielle Risiken birgt. Darüber hinaus gibt es nur wenige Berichte, die Chuanmutong und verwandte Pflanzen vergleichen und identifizieren. Folglich ist eine Qualitätskontrollmethode, um die Authentizität von Chuanmutong sicherzustellen, eine weitere Untersuchung wert.
Die chemischen Bestandteile von Chuanmutong bestehen hauptsächlich aus pentacyclischen Triterpenoiden vom Oleanan-Typ und ihren Glykosiden, Flavonoiden und organischen Säuren11,12,13,14. Unter ihnen haben Oleanolsäure, β-Sitosterin, Stigmasterol und Ergosterol harntreibende Wirkungen unterschiedlicher Intensität, die potenzielle pharmakodynamische Substanzen zur Förderung der Diurese und Linderung der Strangurie sein können15,16. Chemische Fingerabdrücke werden durch Trennung und Detektion vieler chemischer Komponenten, die in Proben enthalten sind, durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC), Gaschromatographie (GC) usw. erhalten. Die Anwendung geeigneter statistischer Analysemethoden zur Analyse der Eigenschaften von Chuanmutong kann die allgemeine Qualitätskontrolle und wissenschaftliche Identifizierung der traditionellen chinesischen Medizinbestimmen 17,18,19.
In dieser Studie wurden 10 Chargen authentischer Chuanmutong-Sorten und fünf Chargen von Verfälschungsmitteln gesammelt. Ihre Qualität wurde durch die HPLC-Fingerabdruckmethode in Kombination mit Multi-Pattern-Erkennung verglichen und analysiert, einschließlich Clusteranalyse (CA), Hauptkomponentenanalyse (PCA), orthogonale partielle Least-Squares-Diskriminierungsanalyse (OPLS-CA) und Inhaltsbestimmung der pharmakodynamischen Komponente. Dieses Protokoll legt eine Methode zur Identifizierung authentischer Sorten mit hoher Spezifität fest, eine neue Strategie für die wissenschaftliche Identifizierung authentischer Sorten und Verfälschungsmittel chinesischer Arzneimittel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Probenentnahme für die Forschung ist der erste wichtige Schritt zum Aufbau einer Multimustererkennung zur Identifizierung der Authentizität chinesischer Arzneimittel. Durch Marktforschung fanden wir heraus, dass Sichuan Ya’an, Liangshan und Leshan die Hauptproduktionsgebiete für wilde Ressourcen von Chuanmutong sind. Die verwandten Sorten derselben Gattung haben auch die gleiche geographische Verbreitung 6,20; CC, DC, DE, XS und SMT werden oft als Chuangmu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom Projekt der Sichuan Traditional Chinese Medicine Administration (Nr. 2020JC0088, Nr. 2021MS203) unterstützt.
Materials
| Acetic acid | Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 2017381038 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich Trading Co., Ltd., Shanghai, China | WXBD5243V | |
| β-Sitosterol | Meisai Biological Technology Co., Ltd., Chongqing, China | 20210201 | |
| C18 column | Yuexu Material Technology Co., Ltd., Shanghai, China | Welch Ultimate LP | |
| Chuanmutong | Guoqiang Chinese Herbal Pieces Co., Ltd., Sichuan, China | 19020103 | CMT-1 |
| Chuanmutong | Hongya Wawushan Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 200701 | CMT-2 |
| Chuanmutong | Hongpu Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 200701 | CMT-3 |
| Chuanmutong | Hongpu Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 200901 | CMT-4 |
| Chuanmutong | Xinrentai Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 210701 | CMT-5 |
| Chuanmutong | Haobo Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 210401 | CMT-6 |
| Chuanmutong | Xinrentai Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 200901 | CMT-7 |
| Chuanmutong | Wusheng Pharmaceutical Group Co., Ltd., Sichuan, China | 201201 | CMT-8 |
| Chuanmutong | Limin Chinese Herbal Pieces Co., Ltd., Sichuan, China | 201001 | CMT-9 |
| Chuanmutong | Yuhetang Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 210501 | CMT-10 |
| Clematis argentilucida (Levl. et Vant.) W. T. Wang | Madzi Bridge, Sanlang Township, Tianquan County, Sichuan, China | – | CC |
| Clematis apiifolia var. obtusidentata Rehd. et Wils. | Heilin Village, Qiliping Township, Hongya County, Sichuan, China | – | DC |
| Clematis peterae Hand.-Mazz. | Huangmu Village, Huangmu Township, Hanyuan County, Sichuan, China | – | DE |
| Clematis gouriana Roxb. Var. finetii Rehd. et Wils | Mixedang Mountain, Huangwan Township, Emei County, Sichuan, China | – | XS |
| Clematis finetiana Levl. et Vaniot. | Wannian Village, Huangwan Township, Emei County, Sichuan, China | – | SMT |
| Electronic balance | Haozhuang Hengping Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai, China | FA1204 | |
| Ergosterol | Meisai Biological Technology Co., Ltd, Chongqing, China | 20210201 | |
| Ethanol | Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China | 2021112602 | |
| Ethyl acetate | Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 2017042043 | |
| Formic acid | Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China | 2016062901 | |
| High performance liquid chromatography | Agilent, USA. | 1260 | |
| IBM SPSS Statistics version 26.0 | International Business Machines Corporation, USA | – | |
| Methanol | Sigma-Aldrich Trading Co., Ltd., Shanghai, China | WXBD6409V | |
| Methanol | Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China | 202010302 | |
| n-butyl alcohol | Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 2020071047 | |
| Petroleum ether | Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 2020090125 | |
| Phosphoric acid | Comeo Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 20200110 | |
| SESCF-TCM version 2012 | National Pharmacopoeia Commission, China | – | http://114.247.108.158:8888/login |
| Stigmasterol | Meisai Biological Technology Co., Ltd., Chongqing, China | 20210201 | |
| Trichloromethane | Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd., Shanghai, China | 20200214 | |
| Umetrics SIMCA version 14.1.0.2047 | Umetrics, Sweden | – | https://www.sartorius.com/en/products/process-analytical-technology/data-analytics-software/mvda-software/simca/simca-free-trial-download |
| Ultrapure water machine | Youpu Ultrapure Technology Co., Ltd., Sichuan, China | UPH-II-10T | |
| Ultrasonic cleaner | Kunshan Hechuang Ultrasound Instrument Co., Ltd., Jiangsu, China | KH3200E |
References
- Chen, C. R. . Chinese Medicine Specimen Picture Book. , 116 (1935).
- Xiong, J., et al. Lignans from the stems of Clematis armandii ("Chuan-Mu-Tong") and their anti-neuroinflammatory activities. Journal of Ethnopharmacology. 153 (3), 737-743 (2014).
- Pan, L. L., et al. a lignan from the Chinese medicinal plant Clematis armandii, inhibits A431 cell growth via blocking p70S6/S6 kinase pathway. Integrative Cancer Therapies. 16 (3), 351-359 (2017).
- Chinese Pharmacopoeia Commission. . Pharmacopoeia of The People’s Republic of China: (Edition 2020). , 38 (2020).
- Wang, D. G., Guo, J. L. Textual research on the materia medica and authenticity of Clematidis armandii. Lishizhen Medicine and Materia Medicine Research. 18 (11), 2696 (2007).
- Fang, Q. M., Zhang, M., Zhong, Y. Y. The natural resources and exploitation of Caulis Clematidis Armandii in Sichuan. West China Journal of Pharmaceutical Sciences. 20 (5), 404-406 (2005).
- Bai, M. N., Dai, Y. X., Wang, Y., Ren, Y. Y., Tan, R. Study on the identification of Caulis Clematidis Armandii. Research and Practice on Chinese Medicines. 31 (3), 13-16 (2017).
- Zhou, P. J., Li, X. F., Fu, D. H., Pu, X. Y., Zhu, G. Q. Pharmacognosy identification of Ethnomedicine Clematis ranunculoides Franchet. Journal of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine. 34 (3), 432-436 (2017).
- Guo, J. L., Tang, Y., Pei, J., Wang, D. G. Study on random amplified polymorphic DNA and sequence characterized amplified regions of Caulis Clematidis Armandii. Journal of Chengdu Medical College. 6 (4), 283-286 (2011).
- Liu, M. Z., Li, M. N., Yao, H., Liu, P. Molecular identification of Clematidis Armandii Caulis and its adulterants and closely related species by ITS2 sequence. Global Traditional Chinese Medicine. 4 (6), 446-450 (2011).
- Liu, J. J., Chen, X., Wei, Z. Q., Li, B. Chemical constituents and identification of the caules of Clematis armandii Franch.and Clematis montana Buch.-Ham. Natural Product Research and Development. 22 (6), 998-1000 (2010).
- Yang, T. R., Xu, Z., Shi, Y. N. Studies on four compounds from Clematis Montana. Journal of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine. 10 (4), 142-143 (2008).
- Yan, L. H., Xu, L. Z., Zhou, Z. M., Yang, S. L. Chemical constituents from stems of Clematis armandii(I). Chinese Traditional and Herbal Drugs. 38 (3), 340-342 (2007).
- Li, X., et al. Traditional uses, phytochemistry, pharmacology, and toxicology of Akebiae Caulis and its synonyms: A review. Journal of Ethnopharmacology. 277, 114245 (2021).
- Ye, X., et al. Diuretic effect and material basis of Clematidis Armandii Caulis in rats. China Journal of Chinese Materia Medica. 44 (9), 1889-1894 (2019).
- Kuang, Y., et al. Consistency study of Caulis Clematidis Armandii and its traditionally used products and counterfeit species based on efficacy and pharmacognosy. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 36 (3), 115-121 (2020).
- Li, Y., et al. Quality assessment of Asarum heterotropoides var. mandshuricum based on HPLC multi-component determination and multiple pattern recognition method of fingerprint. Chinese Traditional and Herbal Drugs. 53 (1), 238-243 (2022).
- Li, Y., et al. Determination of multi-components of Paeoniae Alba Radix based on fingerprints and chemical pattern recognition. Chinese Traditional and Herbal Drugs. 53 (1), 231-237 (2022).
- Li, H. H., et al. Comparative investigation for raw and processed products of Euodiae Fructus based on high-performance liquid chromatography fingerprints and chemical pattern recognition. Chemistry & Biodiversity. 18 (8), 2100281 (2021).
- Dong, L. J., et al. Study on suitable distribution areas of Kawa Kimichi produced in Sichuan province-based on remote sensing and GIS-A case study of Clematis Armandii. Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology. 17 (11), 2398-2404 (2015).
- Tang, S. W., Pei, J., Li, F. Y. Morphological and histological identification of Chuanmutong. West China Journal of Pharmaceutical Sciences. 15 (1), 19-21 (2000).
- Li, B., Chen, X., Fang, Q. M., Zhang, B. J., Wei, Z. Q. Quality Research of Chuanmutong. Journal of Sichuan of Traditional Chinese Medicine. 27 (6), 58-60 (2009).
- Wu, W. J., Wan, M. M., Cao, Y. H., Tan, R., Song, L. K. Research on the Quality Standard of Chuanmutong. Chinese Archives of Traditional Chinese Medicine. 33 (2), 313-315 (2015).
- Wei, Z. Q., Chen, X., Li, B., Dong, X. P. Determination of stigmasterol in Clematis armandii Franch and Clematis montana Buch-Ham. by HPLC. Lishizhen Medicine and Materia Medica Research. 20 (3), 574-575 (2009).
- Qing, L. S., et al. Determination of oleanolic acid in Caulis clematidis armandii by HPLC. West China Journal of Pharmaceutical Sciences. 21 (3), 273-274 (2006).
- Yang, S. D., Wang, R., Fu, D. Y., Guo, J. J., Tan, W. Y. Determination on oleanolic acid in caulis clematidis armandii by microwave assisted extraction-HPLC/MS. Anhui Academy of Agricultural Sciences. 38 (13), 6929-6931 (2010).
