Настоящий протокол сочетает в себе стимуляцию ex vivo и проточную цитометрию для анализа профилей полифункциональных Т-клеток (Т-ПФ) в мононуклеарных клетках периферической крови (PBMCs) у детей, вакцинированных вирусом японского энцефалита (JEV). Метод обнаружения и цветовая схема проточной цитометрии JEV-специфических TPF были протестированы, чтобы обеспечить ссылку для аналогичных исследований.
Т-клеточный иммунитет играет важную роль в борьбе с флавивирусной инфекцией, либо после вакцинации, либо после естественной инфекции. «Качество» Т-клетки необходимо оценивать по функции, а более высокая функция связана с более мощной иммунной защитой. Т-клетки, которые могут одновременно продуцировать два или более цитокинов или хемокинов на одноклеточном уровне, называются полифункциональными Т-клетками (TPF), которые опосредуют иммунные реакции через различные молекулярные механизмы для экспрессии маркеров дегрануляции (CD107a) и секретирования интерферона (IFN)-γ, фактора некроза опухоли (TNF)-α, интерлейкина (IL)-2 или воспалительного белка макрофагов (MIP)-1α. Появляется все больше доказательств того, что TPFтесно связаны с поддержанием долговременной иммунной памяти и защиты и что их повышенная доля является важным маркером защитного иммунитета и важна для эффективного контроля вирусной инфекции и реактивации. Эта оценка относится не только к специфическим иммунным реакциям, но и к оценке перекрестно-реактивных иммунных реакций. Здесь, взяв в качестве примера вирус японского энцефалита (JEV), был протестирован метод обнаружения и цветовая схема проточной цитометрии JEV-специфических TPF, продуцируемых мононуклеарными клетками периферической крови детей, вакцинированных против японского энцефалита, чтобы обеспечить ссылку на аналогичные исследования.
Вирус японского энцефалита (JEV) является важным переносимым комарами вирусом, принадлежащим к роду Flavivirus в семействе Flaviviridae1. Многие страны Азиатско-Тихоокеанского региона уже давно сталкиваются с огромными проблемами общественного здравоохранения из-за огромного бремени болезней, вызванных японским энцефалитом (ЯЭ), но это значительно улучшилось с увеличением доступности различных типов прививок2. Адаптивные защитные иммунные реакции, вызванные естественной инфекцией или вакцинацией, способствуют профилактике и противовирусной регуляции. Гуморальный иммунитет и клеточно-опосредованный иммунитет классифицируются как адаптивный иммунитет, и индукция первого всегда рассматривалась как ключевая стратегия в разработке вакцин, хотя и с относительно ограниченным пониманием в последние3. Однако роль Опосредованного Т-клетками иммунитета в ограничении распространения флавивируса и клиренса вируса все больше внимания уделяется и широко изучается4. Кроме того, Т-клеточный иммунитет не только незаменим в JEV-специфических противовирусных реакциях, но и играет заметную роль в перекрестной защите от вторичной инфекции гетерологичными флавивирусами, что было продемонстрировано в предыдущих исследованиях5. Предполагается, что этот эффект может обойти потенциальные эффекты усиления, опосредованные антителами, при инфекции5. Следует отметить, что такой перекрестно-реактивный Т-клеточный иммунитет важен, особенно при отсутствии вакцин и противовирусных препаратов против флавивирусов. Хотя было проведено много исследований для определения вклада Т-клеток в инфекцию JEV в отношении CD4+ и CD8+ Т-клеток 6,7, соответствующие линии, секретирующие цитокины, и их функциональная диверсификация остаются неопределенными, что означает, что выяснение точных функций хелперных и киллерных Т-клеток затруднено.
Масштаб их противовирусной защиты определяет качество реакций Т-клеток. CD4+ или CD8+ Т-клетки, которые могут сочетать две или более функции, включая секрецию цитокинов и дегрануляцию, характеризуются как полифункциональные Т-клетки (TPFs) при специфической стимуляции на одноклеточном уровне8. CD4 + Т-клетки, которые производят один или несколько цитокинов, могут иметь различные эффекты и иммунные воспоминания. Например, IL-2+ IFN-γ + CD4 + Т-клетки с большей вероятностью образуют долгосрочный эффективный защитный ответ, чем IL-2 + CD4 + Т-клетки9, которые могут быть использованы в качестве важного параметра при оценке эффекта вакцинации. Частота IL-2+ IFN-γ + CD4 + Т-клеток увеличивается у пациентов с длительным непрогрессированием синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД), в то время как CD4 + Т-клетки у пациентов с прогрессированием СПИДа более склонны к производству IFN-γ в одиночку из-за стимулирующего эффекта IL-2 на пролиферацию Т-клеток10. Кроме того, было показано, что подмножество IL-2+ IFN-γ+ TNF-α+ выживает в течение длительного времени in vivo и синергетически способствует функции уничтожения11. Хотя CD8+ Т-клетки с большей вероятностью проявляют цитотоксическую активность, некоторые CD4+ Т-клетки также оснащены цитотоксической активностью в качестве косвенно обнаруженной экспрессии поверхностных молекул CD107a12. Кроме того, некоторые подмножества Т-клеток экспрессируют хемокин MIP-1α, который часто секретируется моноцитами для участия в Опосредованной Т-клетками рекрутации нейтрофилов13. Аналогичным образом, CD8 + TPFs также может быть использован для характеристики универсальности вышеуказанных маркеров. Исследования показали, что стратегия прайм-буст может эффективно вызывать длительный период защитных эффектов TPF 13, которые могут усилить защиту, вызванную вакцинацией. Центральной особенностью при изучении иммунной системы является способность Т-клеток памяти способствовать более сильным, быстрым и эффективным ответам на вторичные вирусные проблемы, чем наивные Т-клетки. Эффекторные Т-клетки памяти (Т-ЭМ) и Т-клетки центральной памяти (Т-СМ) являются важными подмножествами Т-клеток, которые часто дифференцируются составной экспрессией CD27/CD45RO или CCR7/CD45RA14. TCM (CD27+ CD45RO+ или CCR7+ CD45RA–) имеет тенденцию локализоваться во вторичных лимфоидных тканях, в то время как TEM (CD27– CD45RO+ или CCR7– CD45RA–) локализуется в лимфоидных и периферических тканях15,16. TEM обеспечивает немедленную, но не устойчивую защиту, тогда как TCM поддерживает ответ, размножаясь во вторичных лимфоидных органах и генерируя новые эффекторы17. Таким образом, учитывая, что клетки памяти могут опосредуть специфические и эффективные реакции на вирусы, возникают вопросы о вкладе этого подмножества полифункций.
С развитием технологии проточной цитометрии стало обычным делом одновременно обнаруживать маркеры более 10 кластеров, фенотипов и дифференцированных антигенов, что полезно для более обильного аннотирования функциональных иммунологических особенностей на отдельных Т-клетках, чтобы уменьшить неправильную интерпретацию и трудности в понимании фенотипов Т-клеток. В этом исследовании использовались стимуляция ex vivo и проточная цитометрия для анализа профилей TPF в мононуклеарных клетках периферической крови (PBMCs) у детей, вакцинированных JEV. Применяя этот подход, будет расширено понимание краткосрочного и долгосрочного JEV-специфического и даже перекрестно-реактивного Т-клеточного иммунитета, вызванного вакцинацией.
Этот протокол представляет собой осуществимый метод обнаружения на основе проточной цитометрии для профилей TPF в PBMCs детей, вакцинированных вакциной JEV SA14-14-2. В этом исследовании в качестве исследовательских материалов использовались ПБМК венозной крови как вакцинированных, так…
The authors have nothing to disclose.
R.W. был поддержан Национальным фондом естественных наук Китая (82002130), Пекинским фондом естественных наук Китая (7222059). ZD.X. был поддержан Инновационным фондом медицинских наук CAMS (2019-I2M-5-026).
anti-human CD28 | Biolegend | 302934 | Antibody |
anti-human CD49d | Biolegend | 304339 | Antibody |
APC anti-human MIP-1α | BD | 551533 | Fluorescent antibody |
Automated cell counter | BIO RAD | TC20 | Cell count |
BD FACSymphony A5 | BD | A5 | flow Cytometry |
BUV395 anti-human CD4 | BD | 563550 | Fluorescent antibody |
BUV737 anti-human CCR7 | BD | 741786 | Fluorescent antibody |
BUV737 anti-human CD27 | BD | 612829 | Fluorescent antibody |
BV421 anti-human CD8 | Biolegend | 344748 | Fluorescent antibody |
BV480 anti-human CD45RA | BD | 566114 | Fluorescent antibody |
BV480 anti-human CD45RO | BD | 566143 | Fluorescent antibody |
BV605 anti-human CD107a | Biolegend | 328634 | Fluorescent antibody |
BV650 anti-human CD3 | BD | 563999 | Fluorescent antibody |
BV785 anti-human IL-2 | Biolegend | 500348 | Fluorescent antibody |
Centrifuge Tube | BD Falcon | BD-35209715 | 15 mL centrifuge tube |
Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD | 554714 | Cell fixation and permeabilization |
Density gradient medium | Dakewe | DKW-KLSH-0100 | Ficoll-Paque, human lymphocyte separation medium |
FITC anti-human IFN-γ | Biolegend | 502506 | Fluorescent antibody |
Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | Fetal Bovine Serum |
Gibco RPMI-1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 22400089 | cell culture medium |
High-speed centrifuge | Sigma | 3K15 | Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube |
High-speed centrifuge | Eppendorf | 5424R | Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube |
Microcentrifuge tubes | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL microcentrifuge tube |
PE anti-human TNF-α | Biolegend | 502909 | Fluorescent antibody |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | BI | 02-024-1ACS | PBS |
Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A, GolgiPlug) | BD | 555029 | blocks intracellular protein transport processes |
Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin) | BD | 554724 | blocks intracellular protein transport processes |
Round-bottom test tube | BD Falcon | 352235 | 5 mL test tube |
Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit | Beyotime | C0011 | Trypan Blue Staining |
Zombie NIR Fixable Viability Dye | Biolegend | 423106 | Dead cell stain |