Summary

Analyse de l’afflux de calcium induit par le récepteur des lymphocytes T dans les lymphocytes T murins primaires par cytométrie en flux à spectre complet

Published: December 16, 2022
doi:

Summary

L’afflux de calcium, une mesure de la signalisation des lymphocytes T, est un moyen efficace d’analyser les réponses à la stimulation des récepteurs des lymphocytes T. Ce protocole de multiplexage d’Indo-1 avec des panels d’anticorps dirigés contre les molécules de surface cellulaire tire parti des capacités très flexibles de la cytométrie en flux à spectre complet.

Abstract

L’afflux de calcium en réponse à la stimulation des récepteurs des lymphocytes T est une mesure courante de la signalisation des lymphocytes T. Plusieurs colorants indicateurs de calcium ont été développés pour évaluer la signalisation du calcium par cytométrie en flux passe-bande. Ce protocole est conçu pour mesurer les réponses calciques dans les cellules T murines primaires en utilisant la cytométrie en flux à spectre complet. Les splénocytes totaux sont marqués avec le colorant indicateur de calcium ratiométrique Indo-1, ainsi qu’un panel d’anticorps conjugués au fluorochrome contre les molécules de surface cellulaire. L’exploitation des capacités de la cytométrie en flux à spectre complet fournit une plate-forme pour utiliser un large éventail de colorations de surface cellulaire en combinaison avec Indo-1. Les cellules sont ensuite analysées en temps réel à 37 °C avant et après l’ajout d’un anticorps anti-CD3 pour stimuler le récepteur des lymphocytes T. Après avoir démélangé les signaux spectraux, le rapport de l’Indo-1 lié au calcium et de l’Indo-1 sans calcium est calculé et peut être visualisé au fil du temps pour chaque population fermée de splénocytes. Cette technique peut permettre l’analyse simultanée des réponses calciques dans plusieurs populations cellulaires.

Introduction

L’afflux de calcium induit par le récepteur des lymphocytes T (TCR) est une mesure utile de l’activation des lymphocytes T et est fréquemment utilisé pour déterminer si une population de lymphocytes T a des réponses altérées dans les étapes proximales de la voie de signalisation TCR1. Les mesures de l’afflux de calcium sont généralement effectuées en pré-marquant les lymphocytes T avec un ou une paire de colorants indicateurs de calcium fluorescents, puis en examinant les signaux fluorescents en utilisant la cytométrie de flux en temps réel après réticulation TCR 2,3,4. Indo-1, un colorant calcique proportionnel, est excité par le laser UV avec des émissions de pointe à deux longueurs d’onde différentes en fonction de la liaison au calcium5, et est un colorant indicateur couramment utilisé pour l’analyse par cytométrie en flux des réponses calciques dans les lymphocytes vivants. Comme le profil d’émission d’Indo-1 est assez large, il peut être difficile de combiner l’évaluation de l’Indo-1 avec l’analyse simultanée de plusieurs marqueurs de surface cellulaire par cytométrie en flux passe-bande. Cette limitation limite l’utilisation de l’analyse par cytométrie en flux des réponses calciques aux populations pré-purifiées de lymphocytes T ou aux populations identifiées par un ensemble limité de molécules de surface cellulaire.

Pour remédier aux limites de la mesure des réponses calciques sur des populations hétérogènes de lymphocytes primaires à l’aide de la cytométrie en flux passe-bande, un protocole a été développé pour mesurer la fluorescence Indo-1 à l’aide de la cytométrie en flux à spectre complet. Cette méthode permet de multiplexer Indo-1 avec des panels d’anticorps dirigés contre les molécules de surface cellulaire, en tirant parti des capacités très flexibles de la cytométrie en flux à spectre complet. L’avantage de l’utilisation de la cytométrie en flux à spectre complet par rapport à la cytométrie en flux conventionnelle est sa capacité à distinguer les signaux fluorescents des colorants qui se chevauchent fortement, augmentant ainsi le nombre de marqueurs de surface qui peuvent être évalués simultanément dans chaque échantillon. La cytométrie de flux conventionnelle utilise des filtres passe-bande et est limitée à un fluorochrome par système de détection6. La cytométrie en flux à spectre complet recueille des signaux sur tout le spectre du fluorochrome à l’aide de 64 détecteurs sur un système de cytométrie spectrale en fluxà cinq lasers 7,8. De plus, la cytométrie en flux à spectre complet tire parti des détecteurs APD (Avalanche Photo Diode) qui ont une sensibilité accrue par rapport aux détecteurs à tube photomultiplicateur présents sur les cytomètres en flux conventionnels8. Par conséquent, cette approche est idéale pour les populations cellulaires hétérogènes, telles que les cellules mononucléées du sang périphérique ou les suspensions de cellules d’organes lymphoïdes secondaires murins, car elle élimine le besoin d’isoler des populations spécifiques de lymphocytes T avant le marquage du colorant calcique. Au lieu de cela, les profils d’expression des marqueurs de surface cellulaire et la cytométrie en flux après la collecte de données peuvent être utilisés pour évaluer les réponses au calcium dans chaque population d’intérêt. Comme le montre ce rapport, Indo-1 peut facilement être combiné avec huit anticorps conjugués au fluorochrome, ce qui donne un total de 10 signatures spectrales uniques. En outre, cette méthode peut être facilement appliquée à des mélanges de cellules de lignées de souris congéniquement distinctes, permettant l’analyse simultanée des réponses calciques dans les cellules T de type sauvage par rapport à celles d’une lignée de souris ciblant un gène.

Protocol

Les souris ont été maintenues sur le campus médical Anschutz de l’Université du Colorado conformément aux protocoles de l’IACUC. Toutes les souris ont été euthanasiées selon les normes AAALAC. 1. Préparation des cellules immunitaires de la rate de souris NOTE: Euthanasier les souris naïves avec l’euthanasie au CO2 . Les souris C57BL / 6 achetées aux laboratoires Jackson et élevées en interne sont utilisées pour des expé…

Representative Results

Le flux de travail expérimental pour évaluer les réponses au calcium dans les cellules T murines primaires à l’aide d’un colorant ratiométrique Indo-1 avec des taches de surface multiplexantes est illustré à la figure 1. Après avoir récolté et traité les splénocytes de souris en une seule suspension cellulaire, les cellules sont colorées avec un ester Indo-1 AM et colorées en surface avec des anticorps liés au fluorochrome. Une fois la charge du colorant et la coloration d…

Discussion

Ce protocole décrit un dosage optimisé conçu pour mesurer les réponses calciques dans les lymphocytes T murins primaires chargés de colorant indicateur ratiométrique Indo-1 titré en utilisant la cytométrie en fluxà spectre complet 7,8. L’avantage d’effectuer des tests de flux de calcium à l’aide de la cytométrie en flux à spectre complet est la capacité de multiplexer la coloration des marqueurs cellulaires de surface en combinaison avec l’é…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

R01AI132419, CU | AMC ImmunoMicro Flow Cytometry Shared Resource, RRID:SCR_021321, Un grand merci à nos collègues de Cytek pour les discussions continues sur l’analyse cytométrique spectrale complète sur les logiciels Aurora et SpectroFlo. Les figurines ont été créées avec BioRender.com.

Materials

12 well TC treated plates Cell Treat 229111
50 mL conical Greiner Bio1 41-12-17-03 50 mL Polypropylene centrifuge tubes with cap
5mL polysterene flow tubes Corning 352052
5mL syringe BD syringe 309646 plunger only is used sheith is discarded
70uM filter Greiner bio1 542070
aCD3 (17A2) Biolegend 100202
AKC lysis Buffer Gibco A1049201
Aurora Spectral Flowcytometer https://cytekbio.com/pages/aurora
Bath Beads coleparmer Item # UX-06274-52
CD19 PE Tonbo 50-0193-U100
CD1d Tetramer APC NIH
CD25 PECy7 ebioscience 15-0251
CD4 APC Cy7 Tonbo 25-0042-U100
CD8a FITC ebioscience 11-0081-85
Cell Incubator Formal Scientific
Dissection Tools forceps McKesson #487593 Tissue Forceps McKesson Adson 4-3/4 Inch Length Office Grade Stainless Steel NonSterile NonLocking Thumb Handle 1 X 2 Teeth
Dissection Tools Scissors McKesson #970135 Operating Scissors McKesson Argent™ 4-1/2 Inch Surgical Grade Stainless Steel Finger Ring Handle Straight Sharp Tip / Sharp Tip
DPBS 1x Gibco 14190-136 DPBS 
EGTA Fisher NC1280093
FBS Hyclond SH30071.03 lot AE29165301
FlowJo Software https://www.flowjo.com/
Indo1-AM Ester Dye ebioscience 65-085-39 Calcium Loading Dye 
ionomycin Millipore 407951-1mg
Live/Dead Ghost 540 Tonbo 13-0879-T100
Microcentrifuge tubes 1.7mL Light Labs A-7001
Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine Gibco 10378-016
PRN694 Med Chem Express Hy-12688
Purified Anti-Mouse CD16/CD32 (FC Shield) (2.4G2) Tonbo 70-0161-M001 FC Block
RPMI Gibco 1875093  + phenol red
RPMI phenol free Gibco 11835030  -phenol red
Table top centrifuge Beckman Coulter Allegra612
TCRβ PerCP Cy5.5 ebioscience 45-5961-82
TCRγ/δ Pe Cy5 ebioscience 15-5961-82
Vi-Cell Blu Reagent Pack Product No: C06019 Includes Tripan
Vi-Cell Blu Beckman Coulter
Waterbath Fisher Brand Dry bath

References

  1. Weiss, A., Imboden, J., Shoback, D., Stobo, J. Role of T3 surface molecules in human T-cell activation: T3-dependent activation results in an increase in cytoplasmic free calcium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (13), 4169-4173 (1984).
  2. Huang, G. N. Cell calcium mobilization study (flow cytometry). Bio-Protocol. 2 (9), 171 (2012).
  3. June, C. H., Moore, J. S. Measurement of intracellular ions by flow cytometry. Current Protocols in Immunology. , (2004).
  4. Posey, A. D., Kawalekar, O. U., June, C. H. Measurement of intracellular ions by flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. 72, 1-21 (2015).
  5. Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. The Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).
  6. McKinnon, K. M. Flow cytometry: An overview. Current Protocols in Immunology. 120, 1-11 (2018).
  7. Nolan, J. P., Condello, D. Spectral flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , (2013).
  8. Bonilla, D. L., Reinin, G., Chua, E. Full spectrum flow cytometry as a powerful technology for cancer immunotherapy research. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 612801 (2021).
  9. Zhong, Y., et al. Targeting Interleukin-2-inducible T-cell Kinase (ITK) and Resting Lymphocyte Kinase (RLK) using a novel covalent inhibitor PRN694. The Journal of Biological Chemistry. 290 (10), 5960-5978 (2015).
  10. Gallagher, M. P., et al. Hierarchy of signaling thresholds downstream of the T-cell receptor and the Tec kinase ITK. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (35), 2025825118 (2021).
  11. Andreotti, A. H., Schwartzberg, P. L., Joseph, R. E., Berg, L. J. T-Cell signaling regulated by the tec family kinase, Itk. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (7), 002287 (2010).
  12. Nakamura, Y. EGTA can inhibit vesicular release in the nanodomain of single Ca2+ channels. Frontiers in Synaptic Neurosciene. 11, 26 (2019).
  13. Cytek Aurora Users Guide. Cytek Available from: https://depts.washington.edu/flowlab/Cell%20Analysis%20Facility/Aurora%20User%20Guide.pdf (2022)
  14. SpctroFlo Software. Cytek Available from: https://cytekbio.com/pages/spectro-flo (2022)
  15. FlowJo Software. Becton-Dickinson Available from: https://www.flowjo.com/solutions/flowjo (2022)
  16. Godfrey, D. I., Zlotnik, A. Control points in early T-cell development. Immunology Today. 14 (11), 547-553 (1993).
  17. Vossen, A. C., et al. Fc receptor binding of anti-CD3 monoclonal antibodies is not essential for immunosuppression, but triggers cytokine-related side effects. European Journal of Immunology. 25 (6), 1492-1496 (1995).

Play Video

Cite This Article
Perrenoud, L., Conley, J., Berg, L. J. Analysis of T-cell Receptor-Induced Calcium Influx in Primary Murine T-cells by Full Spectrum Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (190), e64526, doi:10.3791/64526 (2022).

View Video