Un protocollo di compensazione efficace per lo studio dello sviluppo delle sementi nel pomodoro (Solanum lycopersicum L.)

Il pomodoro (S. lycopersicum L.) è una delle colture orticole più importanti in tutto il mondo, con una produzione di 186,8 milioni di tonnellate di frutti carnosi da 5,1 milioni di ettari nel 2020¹. Appartiene alla grande famiglia delle Solanacee con circa 2.716 specie², tra cui molte colture commercialmente importanti come melanzane, peperoni, patate e tabacco. Il pomodoro coltivato è una specie diploide (2n = 2x = 24) con una dimensione del genoma di circa 900 Mb³. Per molto tempo, sono stati fatti grandi sforzi verso l’addomesticamento e l’allevamento del pomodoro selezionando tratti desiderabili da Solanum spp selvatico. Ci sono oltre 5.000 accessioni di pomodoro elencate nel Tomato Genetics Resource Center e più di 80.000 germoplasma di pomodori sono conservati in tutto il mondo⁴. La pianta di pomodoro è perenne nella serra e si propaga per semi. Un seme di pomodoro maturo è costituito da tre compartimenti principali: un embrione adulto, un endosperma di tipo cellulare residuo e un rivestimento di semi duri ^5,6 (Figura 1A). Dopo la doppia fecondazione, lo sviluppo dell’endosperma di tipo cellulare precede lo sviluppo degli zigoti. A ~ 5-6 giorni dopo la fioritura (DAF), il proembrione bicellulare viene osservato per la prima volta quando l’endosperma è costituito da sei a otto nuclei⁷. In Solanum pimpinellifolium, l’embrione si avvicina alla sua dimensione finale dopo 20 DAF e i semi sono vitali per la germinazione dopo 32 DAF⁸. Man mano che l’embrione si sviluppa, l’endosperma viene gradualmente assorbito e solo una piccola quantità di endosperma rimane nel seme. L’endosperma residuo è costituito da endosperma micropilare che circonda la punta della radicola, e endosperma laterale nel resto del seme ^9,10. Il rivestimento esterno del seme è sviluppato dall’epidermide esterna ispessita e lignificata del tegumento e, con gli strati morti dei resti di tegumento, formano un guscio duro per proteggere l’embrione e l’endosperma⁵.

Figura 1: Rappresentazione schematica di un seme maturo in Solanum lycopersicum e Arabidopsis thaliana. (A) Anatomia longitudinale di un seme di pomodoro maturo. (B) Anatomia longitudinale di un seme maturo di Arabidopsis. Un seme di pomodoro maturo è circa 70 volte più grande di un seme di Arabidopsis. Barre della scala = (A) 400 μm, (B) 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

La produzione di semi di pomodoro di alta qualità dipende dalla coordinazione tra l’embrione, l’endosperma e i componenti materni del seme¹¹. La dissezione di geni e reti chiave nello sviluppo dei semi richiede una registrazione fenotipica profonda e completa dei semi mutanti. Le tecniche convenzionali di embedding-sectioning, come la sezione semisottile e la sezione paraffina, sono ampiamente applicate ai semi di pomodoro per osservare le strutture locali e più fini dell’embrione^12,13,14,15. Tuttavia, l’analisi dello sviluppo del seme da sezioni sottili è solitamente laboriosa e manca di risoluzione spaziale dell’asse z. In confronto, la pulizia dei tessuti è un metodo rapido ed efficiente per individuare la fase di sviluppo dei difetti embrionali che hanno maggiori probabilità di verificarsi¹⁶. Il metodo di compensazione riduce l’opacità del tessuto interno omogeneizzando l’indice di rifrazione con uno o più agenti biochimici¹⁶. La pulizia dell’intero tessuto consente l’osservazione di una struttura di tessuto vegetale senza distruggerne l’integrità e la combinazione di tecnologia di clearing e imaging tridimensionale è diventata una soluzione ideale per ottenere informazioni sulla morfologia e sullo stato di sviluppo di un organo vegetale^17,18. Nel corso degli anni, le tecniche di disboscamento dei semi sono state utilizzate in varie specie vegetali, tra cui Arabidopsis thaliana, Hordeum vulgare e Beta vulgaris 19,20,21,22,23. Tra questi, la tecnologia di eliminazione degli ovuli a montaggio intero è stata un approccio efficiente per studiare lo sviluppo dei semi di Arabidopsis, grazie alle sue piccole dimensioni, 4-5 strati della cellula del rivestimento del seme e l’endosperma di tipo nucleare^24,25. Con il continuo aggiornamento di diverse miscele di compensazione, come l’emergere della soluzione²⁶ di Hoyer, le strutture interne dell’ovulo d’orzo sono state visualizzate con un alto grado di chiarezza, sebbene il suo endosperma costituisca la maggior parte dei semi. L’embriogenesi della barbabietola da zucchero può essere osservata mediante pulizia combinata con trattamento sottovuoto e ammorbidimento con acido cloridrico¹⁹. Tuttavia, a differenza delle specie sopra menzionate, non sono state riportate osservazioni embriologiche mediante protocolli di eliminazione nei semi di pomodoro. Ciò impedisce un’indagine dettagliata sullo sviluppo embrionale e delle sementi dei pomodori.

L’idrato di cloralio è comunemente usato come soluzione di compensazione che consente ai tessuti e alle cellule immersi di essere visualizzati su diversi piani ottici e preserva sostanzialmente le cellule o i componenti tissutali^27,28,29. Il protocollo di clearing a base di cloralio idrato è stato utilizzato con successo per la pulizia completa dei semi per osservare l’embrione e l’endosperma di Arabidopsis^21,28. Tuttavia, questa soluzione di compensazione non è efficiente nella pulizia dei semi di pomodoro, che sono più impermeabili dei semi di Arabidopsis. Le barriere fisiche includono: (1) il tegumento del pomodoro ha quasi 20 strati cellulari da 3 a 15 DAF 30,31, (2) l’endosperma del pomodoro è di tipo cellulare, non di tipo nucleare 32, e (3) i semi di pomodoro sono circa 70 volte più grandi in termini di dimensioni^33,34 e (4) producono grandi quantità di mucillagine del rivestimento del seme^, che blocca la penetrazione dei reagenti di compensazione e influenza la visualizzazione delle cellule embrionali.

Pertanto, questo rapporto presenta un metodo di pulizia ottimizzato a base di idrato di cloralio per la pulizia a montaggio intero dei semi di pomodoro in diverse fasi, che consente l’imaging profondo del processo di sviluppo dell’embrione (Figura 2).