Microiniezioni ventricolari cerebrali di lipopolisaccaride in larve di zebrafish per valutare la neuroinfiammazione e la neurotossicità
Summary
Questo protocollo dimostra la microiniezione di lipopolisaccaride nella regione ventricolare del cervello in un modello larvale di zebrafish per studiare la risposta neuroinfiammatoria risultante e la neurotossicità.
Abstract
La neuroinfiammazione è un attore chiave in vari disturbi neurologici, comprese le malattie neurodegenerative. Pertanto, è di grande interesse ricercare e sviluppare modelli alternativi di neuroinfiammazione in vivo per comprendere il ruolo della neuroinfiammazione nella neurodegenerazione. In questo studio, è stato sviluppato e convalidato un modello larvale di zebrafish di neuroinfiammazione mediata da microiniezione ventricolare di lipopolisaccaride (LPS) per indurre una risposta immunitaria e neurotossicità. Le linee transgeniche di zebrafish elavl3:mCherry, ETvmat2:GFP e mpo:EGFP sono state utilizzate per la quantificazione in tempo reale della vitalità dei neuroni cerebrali mediante imaging live a fluorescenza integrato con l’analisi dell’intensità di fluorescenza. Il comportamento locomotore delle larve di zebrafish è stato registrato automaticamente utilizzando un registratore di tracciamento video. Il contenuto di ossido nitrico (NO) e i livelli di espressione dell’mRNA delle citochine infiammatorie tra cui l’interleuchina-6 (IL-6), l’interleuchina-1β (IL-1β) e il fattore di necrosi tumorale umano α (TNF-α) sono stati studiati per valutare la risposta immunitaria indotta da LPS nella testa larvale del pesce zebra. A 24 ore dopo l’iniezione ventricolare cerebrale di LPS, sono stati osservati perdita di neuroni e deficit di locomozione nelle larve di zebrafish. Inoltre, la neuroinfiammazione indotta da LPS ha aumentato il rilascio di NO e l’espressione di mRNA di IL-6, IL-1β e TNF-α nella testa delle larve di zebrafish 6 giorni dopo la fecondazione (DPF) e ha portato al reclutamento di neutrofili nel cervello del pesce zebra. In questo studio, l’iniezione di zebrafish con LPS ad una concentrazione di 2,5-5 mg/ml a 5 dpf è stata determinata come condizione ottimale per questo test farmacologico di neuroinfiammazione. Questo protocollo presenta una metodologia nuova, rapida ed efficiente per la microiniezione di LPS nel ventricolo cerebrale per indurre neuroinfiammazione e neurotossicità mediate da LPS in una larva di zebrafish, che è utile per studiare la neuroinfiammazione e potrebbe anche essere utilizzata come test di screening farmacologico in vivo ad alto rendimento.
Introduction
La neuroinfiammazione è stata descritta come un fattore antineurogeno cruciale coinvolto nella patogenesi di diverse malattie neurodegenerative del sistema nervoso centrale (SNC)1. A seguito di insulti patologici, la neuroinfiammazione può provocare varie conseguenze avverse, tra cui l’inibizione della neurogenesi e l’induzione della morte delle cellule neuronali 2,3. Nel processo alla base della risposta all’induzione dell’infiammazione, citochine infiammatorie multiple (come TNF-α, IL-1β e IL-6) sono secrete nello spazio extracellulare e agiscono come componenti cruciali nella morte neuronale e nella soppressione della neurogenesi 4,5,6.
La microiniezione di mediatori dell’infiammazione (come IL-1β, L-arginina ed endotossine) nel cervello può causare riduzione delle cellule neuronali e neuroinfiammazione 7,8,9. Il lipopolisaccaride (LPS, Figura 1), un’endotossina patogena presente nella parete cellulare dei batteri Gram-negativi, può indurre neuroinfiammazione, esacerbare la neurodegenerazione e ridurre la neurogenesi negli animali10. L’iniezione di LPS direttamente nel SNC del cervello del topo ha aumentato i livelli di ossido nitrico, citochine pro-infiammatorie e altri regolatori11. Inoltre, l’iniezione stereotassica di LPS nell’ambiente cerebrale locale può indurre un’eccessiva produzione di molecole neurotossiche, con conseguente compromissione della funzione neuronale e successivo sviluppo di malattie neurodegenerative 10,12,13,14,15. Nel campo delle neuroscienze, le osservazioni microscopiche dal vivo e nel tempo dei processi cellulari e biologici negli organismi viventi sono cruciali per comprendere i meccanismi alla base della patogenesi e dell’azione farmacologica16. Tuttavia, l’imaging dal vivo di modelli murini di neuroinfiammazione e neurotossicità è fondamentalmente limitato dalla limitata profondità di penetrazione ottica della microscopia, che preclude l’imaging funzionale e l’osservazione dal vivo dei processi di sviluppo17,18,19. Pertanto, lo sviluppo di modelli alternativi di neuroinfiammazione è di grande interesse per facilitare lo studio dello sviluppo patologico e del meccanismo alla base della neuroinfiammazione e della neurodegenerazione, mediante live imaging.
Il pesce zebra (Danio rerio) è emerso come un modello promettente per studiare la neuroinfiammazione e la neurodegenerazione grazie al suo sistema immunitario innato evolutivamente conservato, alla trasparenza ottica, alle grandi dimensioni della frizione embrionale, alla trattabilità genetica e all’idoneità per l’imaging in vivo 19,20,21,22,23 . I protocolli precedenti hanno iniettato direttamente LPS nel tuorlo e nel ventricolo posteriore del pesce zebra larvale senza valutazione meccanicistica, o semplicemente aggiunto LPS all’acqua del pesce (terreno di coltura) per indurre una risposta immunitaria sistemica letale24,25,26,27. Qui, abbiamo sviluppato un protocollo per la microiniezione di LPS nei ventricoli cerebrali, per innescare una risposta immunitaria innata o neurotossicità nelle larve di zebrafish 5 giorni dopo la fecondazione (DPF). Questa risposta è evidenziata dalla perdita di cellule neuronali, dal deficit del comportamento locomotore, dall’aumento del rilascio di ossido di nitrito, dall’attivazione dell’espressione genica infiammatoria e dal reclutamento di neutrofili nel cervello del pesce zebra a 24 ore dopo l’iniezione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Una quantità crescente di dati epidemiologici e sperimentali implica infezioni batteriche e virali croniche come possibili fattori di rischio per le malattie neurodegenerative36. L’infezione innesca l’attivazione dei processi infiammatori e delle risposte immunitarie dell’ospite37. Anche se la risposta agisce come meccanismo di difesa, l’infiammazione iperattivata è dannosa per la neurogenesi e l’ambiente infiammatorio non consente la sopravvivenza dei neuroni neonatali<s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni del Science and Technology Development Fund (FDCT) di Macao SAR (Ref. No. FDCT0058/2019/A1 e 0016/2019/AKP), Comitato di ricerca, Università di Macao (MYRG2020-00183-ICMS e CPG2022-00023-ICMS) e National Natural Science Foundation of China (n. 81803398).
Materials
| Agarose | Sigma-Aldrich | A6361 | |
| Agarose, low gelling temperature | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| Drummond Nanoject III Programmable Nanoliter Injector | Drummond Scientific | 3-000-207 | |
| Fluorescence stereo microscopes | Leica | M205 FA | |
| GraphPad Prism software | GraphPad Software | Ver. 7.04 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4 | Sigma-Aldrich | L3024 | |
| Manual micromanipulator | World Precision Instruments | M3301 | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M5904 | |
| Mx3005P qPCR system | Agilent Technologies | Mx3005P | |
| Nanovue plus spectrophotometer | Biochrom | 80-2140-46 | |
| Nitrite concentration assay kit | Beyotime Biotechnology | S0021M | |
| Phosphate-buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Programmable Horizontal Pipette Puller | World Precision Instruments | PMP-102 | |
| PTU (N-Phenylthiourea) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Random primers | Takara | 3802 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18064014 | |
| SYBR Premix Ex Taq II kit | Accurate Biology | AG11701 | |
| The 3rd Gen Tgrinder | Tiangen | OSE-Y30 | |
| Thin wall glass capillaries (4”) with filament, OD 1.5 mm | World Precision Instruments | TW150F-4 | |
| Tricaine (3-amino benzoic acid ethyl ester) | Sigma-Aldrich | A-5040 | |
| TRNzol Universal reagent | Tiangen | DP424 | |
| Zebrafish tracking box | ViewPoint Behavior Technology |
References
- Xanthos, D. N., Sandkuhler, J. Neurogenic neuroinflammation: inflammatory CNS reactions in response to neuronal activity. Nature Reviews Neuroscience. 15 (1), 43-53 (2014).
- Fan, L. W., Pang, Y. Dysregulation of neurogenesis by neuroinflammation: key differences in neurodevelopmental and neurological disorders. Neural Regeneration Research. 12 (3), 366-371 (2017).
- Kwon, H. S., Koh, S. H. Neuroinflammation in neurodegenerative disorders: the roles of microglia and astrocytes. Translational Neurodegeneration. 9 (1), 42 (2020).
- Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. S. Microglia-mediated neurotoxicity: uncovering the molecular mechanisms. Nature Reviews Neuroscience. 8 (1), 57-69 (2007).
- Tan, E. K., et al. Parkinson disease and the immune system-associations, mechanisms and therapeutics. Nature Reviews Neurology. 16 (6), 303-318 (2020).
- Borsini, A., Zunszain, P. A., Thuret, S., Pariante, C. M. The role of inflammatory cytokines as key modulators of neurogenesis. Trends in Neurosciences. 38 (3), 145-157 (2015).
- Kouhsar, S. S., Karami, M., Tafreshi, A. P., Roghani, M., Nadoushan, M. R. Microinjection of l-arginine into corpus callosum cause reduction in myelin concentration and neuroinflammation. Brain Research. 1392, 93-100 (2011).
- Couch, Y., Davis, A. E., Sá-Pereira, I., Campbell, S. J., Anthony, D. C. Viral pre-challenge increases central nervous system inflammation after intracranial interleukin-1β injection. Journal of Neuroinflammation. 11, 178 (2014).
- Zhao, J., et al. Neuroinflammation induced by lipopolysaccharide causes cognitive impairment in mice. Scientific Reports. 9 (1), 5790 (2019).
- Deng, I., Corrigan, F., Zhai, G., Zhou, X. F., Bobrovskaya, L. Lipopolysaccharide animal models of Parkinson’s disease: Recent progress and relevance to clinical disease. Brain Behavior and Immunity-Health. 4, 100060 (2020).
- Hernandez Baltazar, D., et al. Does lipopolysaccharide-based neuroinflammation induce microglia polarization. Folia Neuropathologica. 58 (2), 113-122 (2020).
- Dutta, G., Zhang, P., Liu, B. The lipopolysaccharide Parkinson’s disease animal model: mechanistic studies and drug discovery. Fundamental and Clinical Pharmacology. 22 (5), 453-464 (2008).
- Castaño, A., Herrera, A. J., Cano, J., Machado, A. Lipopolysaccharide intranigral injection induces inflammatory reaction and damage in nigrostriatal dopaminergic system. Journal of Neurochemistry. 70 (4), 1584-1592 (1998).
- Perez-Dominguez, M., Avila-Munoz, E., Dominguez-Rivas, E., Zepeda, A. The detrimental effects of lipopolysaccharide-induced neuroinflammation on adult hippocampal neurogenesis depend on the duration of the pro-inflammatory response. Neural Regeneration Research. 14 (5), 817-825 (2019).
- Liu, M., Bing, G. Lipopolysaccharide animal models for Parkinson’s disease. Parkinson’s Disease. 2011, 327089 (2011).
- Wilt, B. A., et al. Advances in light microscopy for neuroscience. Annual Review of Neuroscience. 32, 435-506 (2009).
- Huang, S. H., et al. Optical volumetric brain imaging: speed, depth, and resolution enhancement. Journal of Physics D: Applied Physics. 54 (32), 323002 (2021).
- Ahn, C., et al. Overcoming the penetration depth limit in optical microscopy: Adaptive optics and wavefront shaping. Journal of Innovative Optical Health Sciences. 12 (04), 1930002 (2019).
- Saleem, S., Kannan, R. R. Zebrafish: an emerging real-time model system to study Alzheimer’s disease and neurospecific drug discovery. Cell Death Discovery. 4, 45 (2018).
- Hung, M. W., et al. From omics to drug metabolism and high content screen of natural product in zebrafish: a new model for discovery of neuroactive compound. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2012, 605303 (2012).
- Fontana, B. D., Mezzomo, N. J., Kalueff, A. V., Rosemberg, D. B. The developing utility of zebrafish models of neurological and neuropsychiatric disorders: A critical review. Experimental Neurology. 299, 157-171 (2018).
- Sonawane, P. M., et al. A water-soluble boronate masked benzoindocyanin fluorescent probe for the detection of endogenous mitochondrial peroxynitrite in live cells and zebrafish as inflammation models. Dyes and Pigments. 191, 109371 (2021).
- Sonawane, P. M., et al. Phosphinate-benzoindocyanin fluorescent probe for endogenous mitochondrial peroxynitrite detection in living cells and gallbladder access in inflammatory zebrafish animal models. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 267, 120568 (2022).
- Yang, L. L., et al. Endotoxin molecule lipopolysaccharide-induced zebrafish inflammation model: a novel screening method for anti-inflammatory drugs. Molecules. 19 (2), 2390-2409 (2014).
- Rojas, A. M., Shiau, C. E. Brain-localized and intravenous microinjections in the larval zebrafish to assess innate immune response. Bio-Protocol. 11 (7), 3978 (2021).
- Brugman, S. The zebrafish as a model to study intestinal inflammation. Developmental and Comparative Immunology. 64, 82-92 (2016).
- Kim, E. A., et al. Anti-inflammatory effect of Apo-9′-fucoxanthinone via inhibition of MAPKs and NF-kB signaling pathway in LPS-stimulated RAW 264.7 macrophages and zebrafish model. International Immunopharmacology. 59, 339-346 (2018).
- He, Y. L., et al. Angiogenic effect of motherwort (Leonurus japonicus) alkaloids and toxicity of motherwort essential oil on zebrafish embryos. Fitoterapia. 128, 36-42 (2018).
- Lister, J. A. Development of pigment cells in the zebrafish embryo. Microscopy Research and Technique. 58 (6), 435-441 (2002).
- Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Marine Biotechnology. 3 (6), 522-527 (2001).
- d’Amora, M., Giordani, S. The utility of zebrafish as a model for screening developmental neurotoxicity. Frontiers in Neuroscience. 12, 976 (2018).
- Kalueff, A. V., Stewart, A. M., Gerlai, R. Zebrafish as an emerging model for studying complex brain disorders. Trends in Pharmacological Sciences. 35 (2), 63-75 (2014).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Zhang, B., et al. Effects of a dammarane-type saponin, ginsenoside Rd, in nicotine-induced vascular endothelial injury. Phytomedicine. 79, 153325 (2020).
- Chen, Y., Li, G., Law, H. C. H., Chen, H., Lee, S. M. Determination of oxyphylla A enantiomers in the fruits of Alpinia oxyphylla by a chiral high-performance liquid chromatography-multiple reaction monitoring-mass spectrometry method and comparison of their in vivo biological activities. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 68 (40), 11170-11181 (2020).
- De Chiara, G., et al. Infectious agents and neurodegeneration. Molecular Neurobiology. 46 (3), 614-638 (2012).
- Sochocka, M., Diniz, B. S., Leszek, J. Inflammatory response in the CNS: friend or foe. Molecular Neurobiology. 54 (10), 8071-8089 (2017).
- Whitney, N. P., Eidem, T. M., Peng, H., Huang, Y., Zheng, J. C. Inflammation mediates varying effects in neurogenesis: relevance to the pathogenesis of brain injury and neurodegenerative disorders. Journal of Neurochemistry. 108 (6), 1343-1359 (2009).
- Terzi, M., et al. The use of non-steroidal anti-inflammatory drugs in neurological diseases. Journal of Chemical Neuroanatomy. 87, 12-24 (2018).
- Shohayeb, B., Diab, M., Ahmed, M., Ng, D. C. H. Factors that influence adult neurogenesis as potential therapy. Translational Neurodegeneration. 7, 4 (2018).
- Sullivan, C., Kim, C. H. Zebrafish as a model for infectious disease and immune function. Fish and Shellfish Immunology. 25 (4), 341-350 (2008).
- Meeker, N. D., Trede, N. S. Immunology and zebrafish: spawning new models of human disease. Developmental and Comparative Immunology. 32 (7), 745-757 (2008).
- Morales Fenero, C. I., Colombo Flores, A. A., Camara, N. O. Inflammatory diseases modelling in zebrafish. World Journal of Experimental Medicine. 6 (1), 9-20 (2016).
- Mottaz, H., et al. Dose-dependent effects of morphine on lipopolysaccharide (LPS)-induced inflammation, and involvement of multixenobiotic resistance (MXR) transporters in LPS efflux in teleost fish. Environmental Pollution. 221, 105-115 (2017).
- Novoa, B., Bowman, T. V., Zon, L., Figueras, A. LPS response and tolerance in the zebrafish (Danio rerio). Fish and Shellfish Immunology. 26 (2), 326-331 (2009).
- Garcia-Alloza, M., Bacskai, B. J. Techniques for brain imaging in vivo. Neuromolecular Medicine. 6 (1), 65-78 (2004).
- Ford, J., et al. At a glance: An update on neuroimaging and retinal imaging in Alzheimer’s disease and related research. Journal of Prevention of Alzheimer’s Disease. 9 (1), 67-76 (2022).
- Bercier, V., Rosello, M., Del Bene, F., Revenu, C. Zebrafish as a model for the study of live in vivo processive transport in neurons. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 17 (2019).
- Antinucci, P., Hindges, R. A crystal-clear zebrafish for in vivo imaging. Scientific Reports. 6, 29490 (2016).
- Poureetezadi, S. J., Donahue, E. K., Wingert, R. A. A manual small molecule screen approaching high-throughput using zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments. (93), e52063 (2014).
- Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (1), 35-44 (2005).
- Chi, Z., Xu, Q., Zhu, L. A review of recent advances in robotic cell microinjection. Ieee Access. 8, 8520-8532 (2020).
- Wang, W., Liu, X., Gelinas, D., Ciruna, B., Sun, Y. A fully automated robotic system for microinjection of zebrafish embryos. PLoS One. 2 (9), 862 (2007).
- Fu, H. Q., et al. Prolonged neuroinflammation after lipopolysaccharide exposure in aged rats. PLoS One. 9 (8), 106331 (2014).
