Preparación, características, toxicidad y evaluación de la eficacia de la vacuna nasal autoensamblada para tumores de nanoemulsión in vitro e in vivo
Summary
Aquí, presentamos métodos detallados para la preparación y evaluación de la vacuna nasal autoensamblada para tumores de nanoemulsión in vitro e in vivo.
Abstract
Los péptidos epítopos han atraído una atención generalizada en el campo de las vacunas tumorales debido a su seguridad, alta especificidad y producción conveniente; en particular, algunos epítopos restringidos por MHC I pueden inducir una actividad efectiva de linfocitos T citotóxicos para eliminar las células tumorales. Además, la administración nasal es una técnica de administración efectiva y segura para las vacunas tumorales debido a su conveniencia y mejora el cumplimiento del paciente. Sin embargo, los péptidos de epítopos no son adecuados para la administración nasal debido a su pobre inmunogenicidad y falta de eficiencia de administración. Las nanoemulsiones (NE) son sistemas termodinámicamente estables que pueden cargarse con antígenos y administrarse directamente a la superficie de la mucosa nasal. Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV) es el pentapéptido central de la laminina, un péptido de unión a integrina expresado por las células epiteliales respiratorias humanas. En este estudio, se preparó una vacuna intranasal autoensamblada para el tumor NE del péptido epítopo que contiene el péptido sintético IKVAV-OVA257-264 (I-OVA ) mediante un método de emulsificación de baja energía. La combinación de IKVAV y OVA257-264 puede mejorar la captación de antígenos por las células epiteliales de la mucosa nasal. Aquí, establecemos un protocolo para estudiar las características fisicoquímicas mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM), microscopía de fuerza atómica (AFM) y dispersión dinámica de luz (DLS); estabilidad en presencia de proteína mucina; toxicidad mediante el examen de la viabilidad celular de las células BEAS-2B y los tejidos nasales y pulmonares de ratones C57BL/6; captación celular por microscopía de barrido láser confocal (CLSM); perfiles de liberación mediante imágenes de animales pequeños in vivo; y el efecto protector y terapéutico de la vacuna mediante el uso de un modelo portador de tumores E.G7. Anticipamos que el protocolo proporcionará pistas técnicas y teóricas para el desarrollo futuro de nuevas vacunas mucosas de péptidos de epítopos de células T.
Introduction
Como una de las innovaciones de salud pública más importantes, las vacunas desempeñan un papel clave en la lucha contra la carga mundial de enfermedades humanas1. Por ejemplo, en la actualidad, se están probando más de 120 vacunas candidatas para enfermedades COVID-19, algunas de las cuales han sido aprobadas en muchos países2. Informes recientes afirman que las vacunas contra el cáncer han mejorado efectivamente el progreso de los tratamientos clínicos contra el cáncer porque dirigen el sistema inmunológico de los pacientes con cáncer para reconocer los antígenos como extraños al cuerpo3. Además, múltiples epítopos de células T localizados dentro o fuera de las células tumorales pueden ser utilizados para diseñar vacunas peptídicas, que han mostrado ventajas en el tratamiento de cánceres metastásicos debido a la falta de toxicidad significativa asociada con la radioterapia y la quimioterapia 4,5. Desde mediados de la década de 1990, los ensayos preclínicos y clínicos para el tratamiento de tumores se han realizado principalmente utilizando vacunas de péptidos de antígeno, pero pocas vacunas exhiben un efecto terapéutico adecuado en pacientes con cáncer6. Además, las vacunas contra el cáncer con epítopos peptídicos tienen una inmunogenicidad deficiente y una eficiencia de administración insuficiente, lo que puede deberse a la rápida degradación de péptidos extracelulares que se difunden rápidamente desde el sitio de administración, lo que conduce a una absorción insuficiente de antígenos por las células inmunes7. Por lo tanto, es necesario superar estos obstáculos con la tecnología de administración de vacunas.
OVA 257-264, el epítopo MHC de unión a la clase I257-264 expresado como una proteína de fusión, es un epítopo modelo8 de uso frecuente. Además, OVA257-264 es crucial para la respuesta inmune adaptativa contra los tumores, que depende de la respuesta de los linfocitos T citotóxicos (CTL). Está mediada por células T CD8+ específicas de antígeno en el tumor, que son inducidas por el péptido OVA257-264 . Se caracteriza por una insuficiencia de granzima B, que es liberada por las células T citotóxicas, lo que lleva a la apoptosis de las células diana8. Sin embargo, la administración de péptidos OVA257-264 libres puede inducir poca actividad CTL porque la captación de estos antígenos ocurre en células no específicas en lugar de células presentadoras de antígeno (APC). La deficiencia de estimulación inmune adecuada resulta en actividad CTL5. Por lo tanto, la inducción de una actividad eficaz de CTL exige un avance considerable.
Debido a la barrera proporcionada por las células epiteliales y la secreción continua de moco, los antígenos de la vacuna se eliminan rápidamente de la mucosa nasal 9,10. El desarrollo de un vector vacunal eficiente que pueda pasar a través del tejido mucoso es crucial porque las células presentadoras de antígeno están situadas debajo del epitelio de la mucosa9. La inyección intranasal de vacunas teóricamente induce inmunidad mucosa para combatir la infección de la mucosa11. Además, la administración nasal es un método de administración eficaz y seguro para las vacunas debido a su conveniencia, la evitación de la administración intestinal y la mejora de la conformidad del paciente7. Por lo tanto, la administración nasal es un buen medio de administración para la nueva nanovacuna peptídica epitopo.
Se han ideado varios biomateriales sintéticos para combinar epítopos de tejido celular e interacciones célula-célula. Ciertas proteínas bioactivas, como Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV), han sido introducidas como parte de la estructura del hidrogel para conferir bioactividad12. Este péptido probablemente contribuye a la unión celular, la migración y el crecimiento13 y se une a las integrinas α 3β1 y α6β1 para interactuar con diferentes tipos de células cancerosas. IKVAV es un péptido de adhesión celular derivado de la proteína de la membrana basal de laminina αcadena 1 que se utilizó originalmente para modelar el microambiente neural y causar la diferenciación neuronal14. Por lo tanto, encontrar un vehículo de entrega eficiente para esta nueva vacuna es importante para el control de la enfermedad.
Los sistemas de emulsión recientemente reportados, como W805EC y MF59, también se han compuesto para la administración en la cavidad nasal de la vacuna inactivada contra la influenza o el antígeno de superficie de la hepatitis B recombinante y se ha demostrado que desencadenan la inmunidad mucosa y sistémica15. Las nanoemulsiones (NE) tienen las ventajas de una fácil administración y una coformación conveniente con adyuvantes efectivos en comparación con los sistemas de administración de partículasmucosas 16. Se ha informado que las vacunas de nanoemulsión alteran el fenotipo alérgico de una manera sostenida diferente de la desensibilización tradicional, lo que resulta en efectos supresores a largo plazo17. Otros informaron que las nanoemulsiones combinadas con antígenos inmunodominantes específicos de Mtb podrían inducir potentes respuestas de las células de la mucosa y conferir una protección significativa18. Por lo tanto, se diseñó una nueva nanovacuna intranasal autoensamblada con el péptido sintético IKVAV-OVA 257-264 (I-OVA, el péptido que consiste en IKVAV unido a OVA257-264). Es importante evaluar sistemáticamente esta nueva nanovacuna.
El objetivo de este protocolo es evaluar sistemáticamente las características fisicoquímicas, la toxicidad y la estabilidad de la nanovacuna, detectar si la captación de antígenos y los efectos protectores y terapéuticos se potencian utilizando medios técnicos, y elaborar los principales contenidos experimentales. En este estudio, establecimos una serie de protocolos para estudiar las características fisicoquímicas y la estabilidad, determinar la magnitud de la toxicidad de la I-OVA NE a las células BEAS-2B por CCK-8, y observar la capacidad de presentación de antígeno de las células BEAS-2B a la vacuna mediante microscopía confocal, evaluar los perfiles de liberación de esta nueva nanovacuna in vivo e in vitro., y detectar el efecto protector y terapéutico de esta vacuna mediante el uso de un modelo de ratón portador de tumores E.G7-OVA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las nanovacunas funcionalizadas con membranas de inmunocitos tienen grandes ventajas en la terapia dirigida a la enfermedad, y los efectos secundarios se minimizan por propiedades tales como tropismo tumoral único, la identificación de objetivos específicos, circulación prolongada, interacciones intercelulares mejoradas y baja toxicidad sistémica. También se pueden integrar fácilmente con otros módulos de tratamiento para tratar cánceres de forma cooperativa16,20<sup class="xre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por el No. 31670938, 32070924, 32000651 del Programa de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China, No. 2014jcyjA0107 y No. 2019jcyjA-msxmx0159 del Programa de Proyectos de la Fundación de Ciencias Naturales de Chongqing, No. 2020XBK24 y No. 2020XBK26 de los proyectos especiales de la Universidad Médica del Ejército, y No. 202090031021 y No. 202090031035 del Programa Nacional de Innovación y Emprendimiento para estudiantes universitarios.
Materials
| 96-well plates | Corning Incorporated, USA | CLS3922 | |
| Bio-Rad 6.0 microplate reader | Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA | Bio-Rad 6.0 | |
| CCK-8 kits | Dojindo, Japan | CK04 | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf, Germany | 5811000398 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | D9542 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Hyclone (Life Technology, USA) | SH30088.03 | |
| FITC-labeled I-OVA | Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd. |
NA | |
| HF 90/240 Incubator | Heal Force, Switzerland | NA | |
| HPLC | Shanghai Botai Biotechology Co., Ltd. | E2695 | |
| Inverted Microscope | Nikon,Japan | DSZ5000X | |
| IPC-208 | Chong Qing University, China | NA | |
| IVIS system | Caliper Life Science Limited Company | NA | |
| JEM-1230 TEM | JEOL Limited Company of Japan | 1230 TEM | |
| Malvern NANO ZS | Malvern Instruments Ltd., UK | NA | |
| MPLA | Invivogen Lit. Co. |
tlrl-mpla | |
| Neomycin Sulfate Ointment | Shanghai CP General Pharmaceutical Co. , Ltd. | H31022262 | |
| OVA257–264 | Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd. |
NA | |
| RPMI 1640 medium | Hyclone (Life Technology, USA) | SH30809.01 | |
| Synthetic peptide (I-OVA) conjugation of IKVAV-PA | Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd. |
NA | |
| Zeiss LSM800 laser scanning confocal fluorescence microscope | Zeiss, Germany | Zeiss LSM800 |
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