Mevcut protokol, Plasmodiophora brassicae tarafından indüklenen safra kesesi histolojik gözlemi için optimize edilmiş bir yöntemi tanımlamaktadır. Hipokotillerin vibratom kesitleri, hastalığın ilerlemesi sırasında transkripsiyon faktörlerinin ve fitohormonların tutulumunu incelemek için floresan görüntülemeden önce temizlenir. Bu protokol, reçine gömme sınırlamalarının üstesinden gelerek floresan proteinlerinin planta görselleştirmesini sağlar.
Brassica bitkilerinin topraktaki protist Plasmodiophora brassicae tarafından enfeksiyonu, yeraltı organlarında safra oluşumuna yol açar. Safra kesesi oluşumu, hücresel yeniden programlama ve enfekte olmuş bitkinin metabolizmasındaki değişiklikleri gerektirir. Bu, konakçı besinlerin yönlendirildiği patojen odaklı bir fizyolojik lavabo oluşturmak için gereklidir. Bu özel bitki-patojen etkileşiminin ve konakçı büyümesinin ve gelişiminin altüst edildiği ve yeniden şekillendirildiği mekanizmaların tam olarak anlaşılması için, safra oluşumuna eşlik eden iç değişikliklerin hücresel çözünürlükle izlenmesi ve gözlemlenmesi esastır. Floresan lekeleri ve floresan proteinleri birleştiren yöntemler, bitkilerdeki anatomik ve fizyolojik tepkileri incelemek için sıklıkla kullanılır. Ne yazık ki, safra keselerinin büyüklüğü ve düşük şeffaflıkları, mikroskop altında bütüne monte gözlemlerin gerçekleştirilmesinde büyük engeller olarak hareket eder. Ayrıca, düşük şeffaflık, kulüp hastalığı progresyonunu ve safra oluşumunu incelemek için floresan mikroskobunun kullanılmasını sınırlar. Bu makalede, P. brassicae ile enfekte olmuş safraların incelenmesi için epifloresan ve konfokal mikroskopiyi kolaylaştırmak için safra keselerinin sabitlenmesi ve temizlenmesi için optimize edilmiş bir yöntem sunulmaktadır. Hızlı optik temizleme için bir doku temizleme protokolü kullanıldı, ardından anatomik değişiklikleri tespit etmek ve promotör füzyonları ve floresan proteinleri ile etiketlenmiş muhabir çizgileri ile gen ekspresyonunu lokalize etmek için vibratom kesitleme yapıldı. Bu yöntem, nematod kaynaklı sinsiti ve kök düğümleri gibi bitkilerde patojen tarafından tetiklenen diğer yapılarda hücresel ve fizyolojik tepkilerin yanı sıra yaprak safraları ve böceklerin neden olduğu deformasyonları incelemek için yararlı olacaktır.
Patojenlerden veya böceklerden etkilenen bitkiler, istilacının besinleri almasına ve üremesine izin veren anormal yapılar (organ deformasyonları veya safralar) geliştirebilir1. Burada, protist Plasmodiophora brassicae ile enfekte olmuş bitkilerin yeraltı kısımlarında gelişen safra keselerinde meydana gelen değişiklikleri incelemek için etkili bir histopatolojik yaklaşım benimsenmiştir (Şekil 1). Bu patojenle ilişkili küçük iplik, P. brassicae dinlenme sporlarının bitkileri yıllarca istila etme yeteneklerini koruyabilmeleri gerçeğinden kaynaklanmaktadır. Yağlı tohumlu kolza (Brassica napus) büyük ölçekli yetiştiriciliği durumunda, ekonomik faktörler mahsul rotasyonunu kısıtladığı ve toprakta dinlenme sporu birikimine yol açtığı için bu ciddi bir sorundur2. Yağlı tohumlu kolzanın P. brassicae’nin neden olduğu clubroot hastalığına karşı direnci genetik olarak belirlenir. Ne yazık ki, patojen biyolojisi ve yağlı tohum kolzasının kaynaklandığı dar genetik havuz nedeniyle genellikle direnci aşar. Bu nedenle, konakçı bitkilerde enfeksiyon sonrası tepkileri ve hastalığın ilerlemesini yavaşlatma veya belirli semptomların gelişmesini önleme yeteneklerini incelemek uygun hale gelmiştir.
Clubroot hastalığında, şiddet genellikle safra keselerinin gelişimine ve kök sistemi hasarının derecesine göre değerlendirilir. Bu, Hastalık İndeksi-DI olarak bilinir.3. Bununla birlikte, bu bitki-patojen etkileşiminin gerçek değerlendirmesini tam olarak yakalamaz. Özellikle, patojenin kökler içinde nasıl dağıldığını ve bitkinin kısıtlanıp kısıtlanamayacağını ele almaz. P. brassicae dokuları içindeki hareket. Ayrıca, ne ölçüde tahmin etmek kolay değildir. P. brassicae yeraltı organ anatomisini yeniden programlar. Model tesis çalışmaları Arabidopsis thaliana göstermiştir ki P. brassicae enfeksiyon, ksilogenezin inhibisyonuna (hem başlatma hem de olgunlaşma basamakları) ve safra keselerinde floem farklılaşmasının artmasına yol açar.4,5. Dahası, enfekte olmuş bitkilerin köklerinde ve hipokotillerinde, kambiyal hücre soyu mitotik durumdan çıkmaz ve sağlıklı bitkilerden daha uzun süre çoğalır.6. Bu işlem safra kesesinin nihai boyutunu yönetir ve enfekte olmuş bitki içinde üretilen patojen dinlenme sporlarının sayısını belirler. P. brassicaeKonakçıda güdümlü gelişimsel, metabolik ve fizyolojik yeniden programlama çok karmaşıktır7; bu nedenle, safra keselerindeki iç değişikliklerin incelenmesine izin veren araçların uygulanması, bu etkileşimin doğru bir şekilde değerlendirilmesi için çok önemlidir. Yaşam döngüsü ilerlemesi P. brassicae nişasta veya lipit birikimi olarak gözlenebilen konakçı hücre metabolizmasının yeniden programlanması eşlik eder.7,8. Safra keselerinin başarılı mikroskopisinin önündeki en büyük engel, düşük şeffaflıklarından kaynaklanmaktadır. Bu nedenle, safra keselerinde kulüp kökü kaynaklı değişiklikler sunan histolojik örneklerin çoğu, fiksasyon-gömme (balmumu veya reçine) tekniklerinden ve ardından mikrotom kesitinden kaynaklanmaktadır. Bu tür yaklaşımlar, kulüp kökü safralarında aktif olan çok sayıda gen için promotör aktivitesini bulmak için başarıyla kullanılmıştır.4,5 veya gözlemini kolaylaştıran çeşitli boyama teknikleri P. brassicae yaşam döngüsü ilerlemesi9. Bununla birlikte, sabitleme ve gömme aşamalarının zaman alıcı olduğu ve önemli biyomoleküllerin (örneğin, lipitler) kısmen veya tamamen yıkanmasına neden olduğu ve belirli gözlemleri önemli ölçüde engellediği belirtilmelidir. Geçenlerde P. brassicae Konakçıdaki yaşam döngüsü ilerlemesi, içinde SABATH tipi metiltransferazın (PbBSMT) resting spor oluşumunu işaretlemek için gen-spesifik prob kullanıldı10. İyi bir alternatif, bazı hücresel bileşenlerin otofloresansı, floresan protein belirteçleriyle kaynaşmış genlerin 5′- yukarı akış düzenleyici bölgelerinin aktivitesi ve belirli floresan etiketli proteinlerin birikiminin görülebildiği diğer floresan bazlı yöntemlerin kullanılmasıdır. Bununla birlikte, numunelerin düşük şeffaflığına ek olarak, bu tür nesnelerle ilişkili büyük bir dezavantaj, sabitlenmemiş numunelerle çalışmaktır ve bu da kaliteli görüntülerin belgelenebileceği süreyi önemli ölçüde azaltır. 2015 yılında Kurihara ve ark.11 floresan proteinlerinin korunmasını sağlayan ve bitki dokusu örneklerinin şeffaflığını artıran bir temizleme reaktifi geliştirdi. Ek olarak, çok sayıda histolojik leke ile uyumludur. Son zamanlarda, aynı teknik, bitki dokularındaki farklı hücre duvarı bileşenlerini görselleştirmek için başarıyla uygulanmıştır.12,13. Burada, bu protokol çeşitli clubroot safra gelişim yönlerini analiz etmek için kullanılmıştır. İş akışı, safraların sabitlenmesi, vibratom kesitleme, doku temizleme, boyama ve floresan görüntüleme ile başlar. Kişinin ihtiyaçlarına bağlı olarak, doğrudan veya belirli bir boyama işleminden sonra, ortaya çıkan bölümler bir epifloresan veya konfokal mikroskop altında incelemeye tabi tutulabilir. Bu yöntem, fitohormon dengesi ve sinyalleme dahil olmak üzere gen ekspresyonundaki ve fizyolojik tepkilerdeki lokal değişiklikleri incelemek için etkili bir çözüm sunar. Hastalığın ilerlemesi, istirahat sporlarının dağılım paternine ve olgunlaşma dinamiklerine bakarak izlenebilir. Ayrıca, protokol içindeki karakteristik değişiklikleri görüntülemek için kolayca uygulanabilir. P. brassicae ksilogenezin inhibisyonu veya dirençli genotiplerde lokal lignifikasyon olarak görülebilen konakçı bitki savunma yanıtları da dahil olmak üzere enfekte olmuş bitkiler. Bu protokoldeki örnekler, Arabidopsis thaliana model; ancak protokol, Brassicaceae aile. Aşağıda açıklanan yöntem, safra oluşumuna eşlik eden hücresel yapılar ve moleküler değişiklikler hakkında gelecekteki ayrıntılı çalışmaları kolaylaştıracaktır. P. brassicae-enfekte olmuş bitkiler.
Protokolün genel iş akışı oldukça basittir ve safra gelişiminin tüm aşamaları kolayca görüntülenebilir ve karakterize edilebilir (Şekil 2). P. brassicae toprak kaynaklı bir patojen olduğundan, tüm deneyler toprak bazlı sistemlerde yapılmalıdır. Patojen asidik koşulları tercih eder; bu nedenle, kireçle muamele edilmemiş toprak substratları kullanılmalıdır. P. brassicae insanlar için bir tehdit oluşturmasa da, kesinlikle toprak ve su yoluyla yayılabilen bir bitki patojenidir. Bu nedenle, enfekte olmuş bitkinin tüm kısımlarının yanı sıra toprağın, deneyden sonra otoklavlama veya ağartıcı ile muamele edilerek tahrip edilmesi gerekir.
Temizleme çözeltisini safra kesiklerinin vibratom kesilmiş bölümlerine uygulamak, P. brassicae ve konakçı bitki arasındaki biyotrofik etkileşimi inceleme yeteneğini kesinlikle arttırır. Takas protokolü el bölümleri için bile geçerli olsa da, vibratom bölümleri ile daha iyi çalışır. PFA fiksatif numunelerin sabitlenmesi, protokolde kritik bir adım görevi görür, çünkü numuneler daha sonra kesitlemeye devam etmeden önce birkaç gün boyunca 4 ° C’de saklanabilir. Bu, fiksasyon sırasında floresan proteinlerinin ekspresyonundan ve korunmasından ödün vermeden numuneleri sınırlı bir süre saklamak için esneklik sağlar.
Nil Kırmızısı (DMSO veya metanol olarak), reçineyi çözen ve reçineye gömülü bölümleri yok eden hidrofobikliği nedeniyle reçine bölümleriyle uyumlu değildir17. Bu nedenle, vibratom bölümleri, Nil Kırmızısı boyamasının kolayca kullanılabileceği gelişmekte olan safralar içindeki patojen dağılımını ve yaşam döngüsünü incelemek için etkili olduğunu kanıtlamaktadır.
Bu protokolde kullanılan temizleme çözeltisi çok yönlü12’dir ve hücre duvarlarının çeşitli biyomoleküllerini / bileşenlerini (mantar etkileşimlerinde suberin, lignin, selüloz ve kitin) boyamak için farklı kombinasyonlarda çeşitli floresan lekelerinin kullanılmasına izin verir. Floresan GFP belirteç çizgilerinin kesitlerini karşı boyamak ve böylece promotör aktivitesini veya protein birikim paternini, safra kesesinin belirli hücrelerinde veya bölgelerinde patojenin varlığı ile ilişkilendirmek de mümkündür. Bununla birlikte, ksilem ve patojen dolu dev hücrelerden arka plan otofloresansı, temizleme protokolünden sonra bile elimine edilemedi. Bu, safra oluşumunun sonraki aşamalarında, özellikle bir epifloresan mikroskobu kullanırken ve zayıf sinyalleri görüntülerken, floresan belirteçlere bakmak için bir sınırlama sunar.
Floresan sinyallerin düşük ekspresyon/birikim seviyeleri nedeniyle, transkripsiyon faktörlerinin tespit edilmesi zordur, ancak bu teknikle onlar için tatmin edici görüntüler elde etmek mümkündür. Genel olarak, vibratom kesitini doku temizleme yaklaşımıyla birleştirmek, karmaşık safra dokularının histolojik gözlemleri için araç setini genişletir. Bu protokolün esnekliği, doku fiksasyonu sürecini kolaylaştırır ve floresan proteinleri ve promotör aktivitelerini gözlemlemek için taze doku örneklerinin kesilmesi ve görüntülenmesi için gereken süreyi azaltır. Daha fazla iyileştirme ve çeşitli biyomoleküllere özgü diğer floresan boyaları kullanarak, bu yöntem histolojik çalışmalarda ve karmaşık doku organizasyonuna sahip yoğun, opak dokuların görüntü analizinde daha büyük ilerlemelere işaret edecektir. Son zamanlarda, sunulan doku temizleme yöntemi, farklı floresan sinyallerinin11,12,13 eşzamanlı olarak elde edilmesini sağlamak ve birleştirmek için popüler ve yaygın olarak kullanılan bir protokol olarak ortaya çıkmıştır. Bu tür tekniklerdeki gelecekteki gelişmeler ve modifikasyonlar, bitki-patojen etkileşimlerini hücresel düzeyde gözlemlemek için görüntü çözünürlüğünü büyük ölçüde artıracaktır.
The authors have nothing to disclose.
Çalışma, Polonya Ulusal Bilim Merkezi OPUS17 hibe No. 2019/33/B/NZ9/00751 ” Plasmodiophora brassicae Tarafından Enfekte Edilen Bitkilerde Uzun Mesafeli Vasküler Koordinasyon” tarafından desteklenmiştir. Prof. Yrjö Helariutta’ya (Sainsbury Laboratuvarı, Cambridge Üniversitesi) proHCA2::erRFP hattını paylaştığı için teşekkür ederiz.
2N Sulfuric acid (H2SO4) | Roth | UN2796 | pH adjustment |
Agarose | PRONA | BGQT100 | Embedding |
Basic Fuchsin | BIOSHOP | BSF410.5 | Fluorescent dye |
Calcofluor White | Sigma Aldrich | 18909-100ML-F | Fluorescent dye |
Commercial Bleach | Domestos | ||
Cyanoacrylate/ Instant glue | Kropelka | Adhesive | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | BIOSHOP | DMS555.500 | Solvent |
Epifluorescence microscope | Carl Zeiss M2 automated epifluorescence microscope with Colibri LED system | Carl Zeiss M2 | Carl Zeiss Filter Set filter set 38, 43, 49 used |
Fully automated Vibratome | Leica | VT1200 S | |
Lightmeter /Photometer | LI-COR Biosciences | LI-250A + LI-190R quantum sensor | For measuring light intensity within the 400-700nm (PAR) waveband |
Masking tape | For sticking agarose block on mould | ||
Murashige & Skoog Medium (MS Medium) | Duchefa Biochemie | MO222.0050 | Plant Growth Medium |
Nile Red | Sigma Aldrich | N3013-100MG | Fluorescent dye |
Paraformaldehyde PFA | Sigma Aldrich | 158127-100G | Fixative |
Potassium Chloride (KCl) | POCH | 739740114 | PBS component |
Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma Aldrich | P1767-250G | pH adjustment |
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | BIOSHOP | PPM302.500 | PBS component |
Sodium chloride (NaCl) | BIOSHOP | SOD001.1 | PBS component |
Sodium Deoxycholate | Sigma Aldrich | D6750-25G | Clearing Solution |
Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4 · 2H2O) | POCH | 799490116 | PBS component |
Triton X-100 | BIOSHOP | TRX506.100 | Fixative |
Urea | Sigma Aldrich | U5378-100G | Clearing Solution |
Vacuum/Pressure pump and Dessicator | Welch by Gardner Denver | 2522C-02 | For Vacuum Infilteration |
Xylitol | Sigma Aldrich | X3375-25G | Clearing Solution (componenet) |