ניתוח אוטומטי של פנוטיפים תוך תאיים של סלמונלה באמצעות ImageJ
Summary
סלמונלה פולשת ומשתכפלת בתוך תאי אפיתל מעיים הן בוואקולות ספציפיות לסלמונלה והן בחינם בציטוזול (היפר-שכפול). פרוטוקול מבוסס מיקרוסקופיה פלואורסצנטית בתפוקה גבוהה מתואר כאן כדי לכמת את הפנוטיפים התוך-תאיים של סלמונלה על ידי שני ניתוחי תמונה משלימים באמצעות ImageJ, המגיעים לרזולוציה של תא בודד וניקוד.
Abstract
סלמונלה היא פתוגן אנטרי המסוגל לפלוש לאפיתל המעי ולהשתכפל באנטרוציטים, הן בתוך vacuoles ספציפיים לסלמונלה והן חופשיים בציטוזול (שכפול יתר ציטוזולי). פנוטיפים שונים אלה של שכפול תוך-תאי מניעים למסלולים שונים של פתוגנזה, כלומר, שכפול יתר ציטוזולי גורם למוות של תאי דלקת ושחול לתוך לומן המעיים, בעוד שכפול vacuolar מוביל לחדירת טרנס-אפיתל והתפשטות מערכתית. נעשה מאמץ משמעותי ליצור כלי מיקרוסקופיה כדי לחקור את ההתנהגות של סלמונלה בתוך תאים פולשים, כגון פלסמיד כתב פלואורסצנטי pCHAR-Duo המאפשר הבחנה בין חיידקים vacuolar ו cytosolic על ידי ביטוי דיפרנציאלי של mCherry ו- GFP. עם זאת, פנוטיפים תוך תאיים הם לעתים קרובות ניקוד ידני, הליך זמן רב המגביל את הניתוח למספר קטן של דגימות ותאים. כדי להתגבר על מגבלות אלה, פותחו שני ניתוחי תמונה משלימים ואוטומטיים באמצעות ImageJ, תוכנה לניתוח תמונות הזמינה באופן חופשי. בפרוטוקול התפוקה הגבוהה, תאי אפיתל היו נגועים בסלמונלה שנשאה pCHAR-Duo באמצעות צלחות של 96 בארות. ההדמיה בוצעה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי אוטומטי. לאחר מכן, יושמו שתי שיטות לניתוח תמונה כדי למדוד את ההתנהגות התוך-תאית של סלמונלה ברמות פירוט שונות. השיטה הראשונה מודדת את העומס החיידקי התוך-תאי הכולל ואת מידת השכפול ההיפר-שכפול הציטוזולי. הוא מהיר ומאפשר ניקוד של מספר גבוה של תאים ודגימות, מה שהופך אותו למתאים למבחנים בעלי תפוקה גבוהה כגון ניסויי סינון. השיטה השנייה מבצעת אנליזה של תאים בודדים כדי לקבוע את אחוז התאים הנגועים, את העומס הממוצע של סלמונלה, ואת קצב השכפול ההיפר-שכפול הציטוזולי המספק פרטים גדולים יותר על התנהגות סלמונלה בתוך תאי אפיתל. הפרוטוקולים יכולים להתבצע על ידי סקריפטים של ImageJ שתוכננו במיוחד כדי להריץ באופן אוטומטי ניתוחי אצווה של השלבים העיקריים של אינטראקציה סלמונלה-אנטרוציטים.
Introduction
סלמונלה היא החומר החיידקי המדווח ביותר הגורם להתפרצויות של מחלות המועברות במזון באיחוד האירופי1. הביטוי הפתולוגי העיקרי של זיהום סלמונלה הוא דלקת פרקים, שהיא תוצאה של התנהגות הפתוגן במעיים לאחר בליעה והתגובה הדלקתית המקומית כתוצאה מכך2. עם זאת, סלמונלה יכולה גם להפיץ לאתרים מחוץ למעיים ולגרום לזיהום מערכתי, במיוחד אצל אנשים מדוכאי חיסון. סוג האינטראקציה בין סלמונלה לבין אפיתל המעי תנאים את התוצאה של הזיהום. ברגע שהיא מגיעה ללומן המעיים, סלמונלה פולשת לתאי אפיתל המעי ומשתכפלת אליהם. ברמה התוך-תאית, סלמונלה יכולה להציג שני פנוטיפים שונים של שכפול, שכפול יתר ציטוזולי והשכפול האיטי התוך-ואקוולרי בתוך ואקואולים המכילים סלמונלה (SCVs). שכפול יתר ציטוזולי גורם למוות דלקתי של תאי מארח ולשחול סלמונלה לתוך לומן המעי3; שכפול הוואקולאר מוביל לחדירת טרנס-אפיתל ולהתפשטות מערכתית4. לכן, היקף הפלישה והשכפול הציטוזולי לעומת השכפול הציטוזולי משפיע על מהלך ההדבקה.
הסוג סלמונלה הוא מגוון מאוד, כולל אלפי סרוטיפים עם טווחי פונדקאי שונים ויכולות לגרום למחלות. לדוגמה, S. טיפימוריום מוגדר כסרובר כללי, משום שהוא מדביק מספר פונדקאים שאינם קשורים, ומייצג את אחד הגורמים העיקריים לסלמונלוזיס אנושי. אחרת, ס. דרבי נחשב לסרובאר מותאם לחזירים, שכן הוא מבודד ברובו מהחזירים, אך הוא מדווח גם בחמשת הסרוברים האחראים לזיהום אנושי1. עם זאת, הידע על התנהגות החיידקים בתוך תאי האפיתל מוגבל למעשה לחקר כמה זני ייחוס, כמו S. טיפימוריום SL1344, שאינם מייצגים את המגוון הטבעי העצום של פתוגניות סלמונלה . אפיון האינטראקציה של זנים שונים של סלמונלה עם תאי אפיתל יתרום להבנת הפתוגניות השונה שלהם. מסיבה זו, פותח פרוטוקול מבוסס מיקרוסקופיה פלואורסצנטית בתפוקה גבוהה כדי לנתח את ההתנהגות התוך-תאית של מספר רב של זנים באופן מהיר ואוטומטי במידה רבה. בפרוטוקול זה, זיהום של תאי אפיתל בוצע בלוחות הדמיה של 96 בארות ורכישת התמונה נעשתה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי אוטומטי. פלסמיד pCHAR-Duo שימש לצפייה בפנוטיפים של פלישה ושכפול של סלמונלה בתוך תאי אפיתל באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית5. פלסמיד זה נושא את הגן המקודד את כתב הפלואורסצנט האדום mCherry, המתבטא באופן מכונן על ידי כל תאי החיידקים המומרים, ואת הגן המקודד את כתב הפלואורסצנט הירוק GFP, שביטויו מופעל על ידי גלוקוז-6-פוספט הנמצא אך ורק בציטוזול של תאים אאוקריוטים ונעדר ב- SCVs. לכן, הפלסמיד מאפשר הבחנה בין חיידקים vacuolar ו cytosolic על ידי ביטוי דיפרנציאלי של mCherry ו GFP כתבים.
החיידקים הוואקולאריים והציטוזוליים בתמונות מיקרוסקופיה מכמתים בדרך כלל על ידי ניקודידני 6, אך זוהי שיטה הגוזלת זמן רב המגבילה את הניתוח למספר קטן של דגימות. לכן, שני ניתוחי תמונה משלימים ואוטומטיים פותחו – ניתוח אזור ואנליזה של תא בודד – באמצעות ImageJ7, תוכנה לניתוח תמונות הזמינה באופן חופשי. ניתוח השטח מודד את עומס החיידקים התוך-תאיים הכולל ואת היקף ההיפר-שכפול הציטוזולי באמצעות נתונים של אזורים שנכבשו על ידי תאי אפיתל, סלמונלה אדומה וירוקה בכל תמונת מיקרוסקופיה נרכשת. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על תמונות שנרכשו בהגדלה נמוכה; לכן, זה מאפשר להבקיע מספר גבוה של תאי אפיתל עם מעט תמונות, קיצור זמן הרכישה. אנליזת התא הבודד משתמשת בפילוח תאים כדי לקבוע את אחוז התאים הנגועים, את העומס הממוצע של הווקולאר ואת אחוז התאים הנגועים שעוברים שכפול יתר ציטוזולי ברזולוציה של תא בודד.
בפרוטוקול זה, כל השלבים של ניתוח התמונה מתוארים בפירוט כדי להתבצע באופן ידני, אך אותו ניתוח יכול להיות אוטומטי על ידי סקריפטי ImageJ שתוכננו במיוחד שלנו. סקריפטים אלה מאפשרים גם להריץ ניתוחי אצווה כדי לנתח באופן אוטומטי תמונות מרובות ובכך להאיץ את ביצוע השיטה.
Protocol
Representative Results
Discussion
האופן שבו סלמונלה מאכלסת תאי אפיתל במעיים, משפיע על תוצאת הזיהום. עם הפלישה, שכפול יתר ציטוזולי גורם לדלקת במעיים3, ואילו שכפול vacuolar יכול להוביל להתפשטות מערכתית4. זני סלמונלה יכולים להשתנות ביכולתם לפלוש ולשכפל בתוך תאי אפיתל מעיים9. ואכן, סלמונלה היא סוג מגוון ביותר הכולל יותר מ -2,500 סרוברים, אשר יש יכולות שונות לגרום למחלות. בנוסף, סלמונלה היא הגורם המדווח ביותר של התפרצויות מזון באיחוד האירופי, המציין התפשטות גדולה באוכלוסייה האנושית1. לכן, הזמינות של שיטות אמינות בתפוקה גבוהה לכימות הפנוטיפים התוך-תאיים של סלמונלה היא בעלת חשיבות רבה להערכת ההבדלים באלימות בין מספר גדול של זני סלמונלה ובסופו של דבר לאפשר הערכת סיכונים מדויקת וספציפית לזן של פתוגן זה.
הפרוטוקול המתואר כאן מודד את ההתנהגות של סלמונלה בתוך תאי אפיתל בצורה מהירה ואוטומטית. הזיהום של תאי אפיתל מבוצע במיקרו-לוחות הדמיה של 96 בארות ומיקרוסקופ פלואורסצנטי אוטומטי משמש לרכישת תמונה, מה שהופך את הפרוטוקול למתאים ליישומים בעלי תפוקה גבוהה. פרוטוקול זה מנצל את פלסמיד pCHAR-Duo, המאפשר להבחין בין vacuolar לבין סלמונלה ציטוזולית באמצעות ביטוי דיפרנציאלי של שני כתבים פלואורסצנטיים5. הפנוטיפים התוך-תאיים של סלמונלה מנותחים לעתים קרובות על ידי ניקוד ידני, הליך גוזל זמן שאינו מתאים לניתוח של מספר רב של זנים ותרביות תאים לכל זן ונוטה לטעויות מפעיל ולשונות בין-מפעילה. כדי להתגבר על מגבלות אלה, פותחו שני ניתוחי תמונה משלימים ואוטומטיים, ניתוח השטח וניתוח התא הבודד. ImageJ, תוכנה זמינה באופן חופשי, שימשה לפיתוח שני הניתוחים. על מנת להאיץ את ביצוע הפרוטוקול, סקריפטים של ImageJ לניתוח אצווה של קבצי רכישה מרובים ללא התערבות מפעיל מסופקים כקבצים משלימים.
ניתוח השטח נועד לכמת, בכמה שלבים, את ההתיישבות הכוללת של תאי אפיתל (יחס זיהום) ואת רמת ההיפר-שכפול (יחס היפר-שכפול) באמצעות מדידת האזורים שנכבשו במיוחד על ידי גרעיני תאי אפיתל ועל ידי סלמונלה המבטאים mCherry או mCherry יחד עם GFP. ניתוח השטח מיושם על תמונות שנרכשו בהגדלה נמוכה, כאשר גם סלמונלי vacuolar וגם Salmonellae היפר-שכפול נמצאים במוקד באותו מישור z, ומספר רב של תאי אפיתל מוצג לכל שדה מיקרוסקופי, מה שמקטין את הגודל והמספר של קבצי הרכישה. ניתוח השטח מאפשר אנליזה אוטומטית, מהירה וקלה חישובית של מספר רב של דגימות, מה שהופך אותו למתאים לבדיקות בתפוקה גבוהה כגון ניסויי סינון.
האנליזה החד-תאית נועדה לכמת פנוטיפים של סלמונלה בתוך תאי אפיתל ברזולוציה חד-תאית, המתקבלת באמצעות פילוח תאים ומדידה של האזור התאי ואחוז השטח שנכבש על ידי סלמונלה ואקולארית וציטוזולית. ההתיישבות הכוללת של תאי אפיתל המאופיינת באמצעות ניתוח השטח מחולקת כאן לשלושה פרמטרים כמותיים, אחוז התאים הנגועים, עומס הוואקולאר הממוצע וקצב השכפול ההיפר, המאפשרים להעריך ולכמת את תרומתו של כל פנוטיפ לקולוניזציה הכוללת, ולכן, להשלים את תוצאות ניתוח האזור. הפרטים הגדולים יותר שמציע הניתוח החד-תאי באים במחיר של רכישה וניתוח איטיים יותר של תמונות. למעשה, על מנת להשיג רזולוציה של תא בודד, רכישת התמונה מתבצעת בהגדלה גבוהה. משמעות הדבר היא כי יש צורך במישורי z מרובים כדי לבחון הן סלמונלה vacuolar והן סלמונלה ציטוסולית במיקוד וכי יש צורך ברכישת מספר רב של שדות לכל דגימה כדי להבקיע מספר גבוה של תאי אפיתל, ובכך להאריך את זמן הרכישה בהשוואה לניתוח שטח. יתר על כן, ניתוח של מספר קבצי רכישה גדולים הוא תובעני מבחינה חישובית, ולכן דורש תחנת עבודה מתאימה (תחנת עבודה 6 ליבות, 32 GB RAM שימש). לכן, ניתוח של תא בודד יכול לשמש כעצמאי בתנאי תפוקה מוגבלים או כשיטה ברמה שנייה המשולבת לניתוח האזור כדי להשיג הבנה מעמיקה יותר של פנוטיפים של סלמונלה בתוך תאי אפיתל.
שני הניתוחים המשלימים אומתו באמצעות S. תמ, ס. דרבי wt, ו– S. Derby ΔsipA, שנבחר משום שהתנהגותם בתוך תאי אפיתל כבר הייתה ידועה כשונה מבחינת פלישה או שכפול 9,10. תוצאות האזור וניתוחים חד-תאיים מראים כי הפרוטוקול איפשר להבחין באופן כמותי בהבדלים בפנוטיפים של סלמונלה תוך תאית בהתאם למאפייני הזנים שנבדקו. יתר על כן, תוצאות אלה מראות כי ניתוח התא הבודד מאפשר לכמת את התרומה של כל פנוטיפ תוך תאי (פלישה, עומס vacuolar ושכפול ציטוזולי) להתיישבות הכוללת שהושגה באמצעות ניתוח האזור.
פרוטוקול זה יושם כאן כדי לחקור פתוגניות במבחנה של זנים שונים של סלמונלה, אך יכולים להיות לו יישומים אחרים כגון מחקר של מוטציות אקראיות לזיהוי גנים המעורבים בפלישה ו/או שכפול בתוך תאי אפיתל. בנוסף, ניתן להתאים את הפרוטוקול כדי לנתח את ההתנהגות של סלמונלה בתוך קווי תאים אחרים מאשר תאי INT407. זה יכול לשמש גם כנקודת מוצא לפיתוח שיטות דומות לחקר אינטראקציה בין תאים לפתוגנים של מיקרואורגניזמים תוך-תאיים אחרים.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להודות לד”ר אוליביה סטיל-מורטימר על שיתוף פלסמיד pCHAR-Duo. עבודה זו מומנה על ידי משרד הבריאות האיטלקי, מענקים PRC2019014 ו- PRC2021004.
Materials
| 96-well imaging microplate | Eppendorf | 30741030 | Cell culture and infection |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | 59349 | Bacteria culture |
| Axio observer inverted microscope | ZEISS | Automated fluorescence microscope | |
| Axiocam 305 Mono | ZEISS | Microscope Camera | |
| Breathable sealing membrane | Sigma-Aldrich | Z380059 | Infection assay |
| Colibrì 5/7 | ZEISS | Led light source | |
| Collagen I rat tail | Life Technologies | A1048301 | Collagen coating |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | Cell staining |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10099-141 | Cell culture and infection |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G12664 | Infection assay |
| Glacial acetic acid | Carlo Erba | 401391 | Collagen coating |
| HCS CellMask Blue | Invitrogen | H32720 | Cell staining |
| ImageJ | National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation (LOCI, University of Wisconsin) | Image processing software | |
| Minimum Essential Eagle's Medium | Sigma-Aldrich | M5650-500ML | Cell culture and infection |
| Paraformaldehyde 4% | Invitrogen | FB002 | Cell fixation |
| Potassium chloride | PanReac AppliChem | 131494.1211 | PBS preparation |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 60220 | PBS preparation |
| Sodium Chloride | PanReac AppliChem | 131659.1214 | Bacteria culture and PBS preparation |
| Sodium phosphate Dibasic | Sigma-Aldrich | 71640 | PBS preparation |
| Tissue Culture Flask 25 cm2 plug seal screw cap | Euroclone | ET7025 | Cell culture |
| Triton X-100 | Biorad | 1610407 | Cell staining |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | Cell culture and infection |
| Tryptone | Oxoid | LP0042B | Bacteria culture |
| Yeast extract | Biolife | 4122202 | Bacteria culture |
References
- European Food Safety Authority & European Centre for Disease Prevention and Control. The European Union One Health 2020 Zoonoses Report. EFSA Journal. 19 (12), 6971 (2021).
- Fattinger, S. A., Sellin, M. E., Hardt, W. D. Salmonella effector driven invasion of the gut epithelium: breaking in and setting the house on fire. Current Opinion in Microbiology. 64, 9-18 (2021).
- Knodler, L. A., et al. Dissemination of invasive Salmonella via bacterial-induced extrusion of mucosal epithelia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (41), 17733-17738 (2010).
- Fulde, M., et al. Salmonella SPI2 T3SS mediates transcytosis in polarized enterocytes in vivo. Cell Host & Microbe. , (2019).
- Cooper, K. G., Chong, A., Starr, T., Finn, C. E., Steele-Mortimer, O. Predictable, tunable protein production in Salmonella for studying host-pathogen interactions. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 475 (2017).
- Klein, J. A., Grenz, J. R., Slauch, J. M., Knodler, L. A. Controlled activity of the Salmonella invasion-associated injectisome reveals its intracellular role in the cytosolic population. mBio. 8 (6), 01931 (2017).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Ibarra, J. A., et al. Induction of Salmonella pathogenicity island 1 under different growth conditions can affect Salmonella-host cell interactions in vitro. Microbiology. 156 (4), 1120-1133 (2010).
- Tambassi, M., et al. Mutation of hilD in a Salmonella Derby lineage linked to swine adaptation and reduced risk to human health. Scientific Reports. 10 (1), 21539 (2020).
- Finn, C. E., Chong, A., Cooper, K. G., Starr, T., Steele-Mortimer, O. A second wave of Salmonella T3SS1 activity prolongs the lifespan of infected epithelial cells. PLoS Pathogens. 13 (4), 1006354 (2017).
- Knodler, L. A., Nair, V., Steele-Mortimer, O. Quantitative assessment of cytosolic Salmonella in epithelial cells. PLoS One. 9 (1), 84681 (2014).
- Chong, A., Starr, T., Finn, C. E., Steele-Mortimer, O. A role for the Salmonella Type III Secretion System 1 in bacterial adaptation to the cytosol of epithelial cells. Molecular Microbiology. 112 (4), 1270-1283 (2019).
