Denne protokollen beskriver tre metoder for administrering av kardioaktive terapeutiske midler i en svinemodell. Kvinnelig landrasesvin fikk behandling gjennom enten: (1) torakotomi og transepikardial injeksjon, (2) kateterbasert transendokardial injeksjon, eller (3) intravenøs infusjon via halsvene osmotisk minipumpe.
Hjerteinfarkt er en av de ledende årsakene til død og funksjonshemming over hele verden, og det er et presserende behov for nye kardioprotektive eller regenerative strategier. En viktig komponent i stoffutvikling er å bestemme hvordan en ny terapeutisk skal administreres. Fysiologisk relevante stordyrmodeller er av avgjørende betydning for å vurdere gjennomførbarhet og effekt av ulike terapeutiske leveringsstrategier. På grunn av deres likheter med mennesker i kardiovaskulær fysiologi, koronar vaskulær anatomi og hjertevekt til kroppsvektforhold, er svin en av de foretrukne artene i den prekliniske evalueringen av nye terapier for hjerteinfarkt. Denne protokollen beskriver tre metoder for administrering av kardioaktive terapeutiske midler i en svinemodell. Etter perkutant indusert hjerteinfarkt fikk kvinnelig landrasesvin behandling med nye midler gjennom enten: (1) torakotomi og transepikardial injeksjon, (2) kateterbasert transendokardial injeksjon eller (3) intravenøs infusjon via halsvene osmotisk minipumpe. Prosedyrene som brukes for hver teknikk er reproduserbare, noe som resulterer i pålitelig kardioaktiv legemiddellevering. Disse modellene kan enkelt tilpasses individuelle studiedesign, og hver av disse leveringsteknikkene kan brukes til å undersøke en rekke mulige tiltak. Derfor er disse metodene et nyttig verktøy for translasjonsforskere som forfølger nye biologiske tilnærminger i hjertereparasjon etter hjerteinfarkt.
Koronarsykdom (CAD) og assosiert ST-elevasjonsinfarkt (STEMI) er de viktigste dødsårsakene over hele verden. I løpet av de siste to tiårene har det blitt gjort store fremskritt i å redusere sykehusdødeligheten til pasienter som presenterer STEMI, gjennom bruk av perkutan koronar intervensjon, fibrinolytiske terapier og standardisering av behandlingsalgoritmer for å sikre at reperfusjon oppnås i tide. 1,2,3. Til tross for dette er sykeligheten knyttet til ST-elevasjonsinfarkt fortsatt en betydelig belastning, noe som skaper et stort behov for å utvikle nye kardioprotektive og regenerative terapier 2,3. En viktig del av terapeutisk utvikling er bestemmelsen av hvordan en ny terapi skal administreres4. Sikkerheten, effekten og gjennomførbarheten til hver metode må matches med egenskapene til selve terapien.
Fysiologisk relevante stordyrmodeller er avgjørende for å vurdere disse egenskapene til ulike terapeutiske leveringsstrategier5. På grunn av deres likheter med mennesker i kardiovaskulær fysiologi, koronar vaskulær anatomi og hjertevekt til kroppsvektforhold, er svin en av de foretrukne artene i den prekliniske evalueringen av nye terapier for hjerteinfarkt6. Vi har tidligere brukt en STEMI-modell for svin for å demonstrere den reparative kapasiteten til en rekombinant proteinterapi7, og fortsetter å undersøke nye farmakologiske, cellulære og genetiske terapier ved hjelp av denne modellen. Her beskrives tre teknikker for terapeutisk administrasjon brukt i svinemodeller etter infarktopprettelse: torakotomi og transepikardial injeksjon, perkutan transendokardial injeksjon og jugulær venøs osmotisk minipumpeimplantasjon. De to første metodene muliggjør lokal vevslevering, reduserer nødvendige doser, off-target effekter og hepatisk førstepassasjemetabolisme 8,9,10. Den osmotiske minipumpen tillater kontinuerlig levering av et legemiddel med kort halveringstid, og eliminerer avhengigheten av en infusjonspumpe og patent intravenøs kanyle, som begge er utfordrende å innføre i store dyremodeller.
Ved å beskrive disse teknikkene, er det håpet at denne artikkelen kan hjelpe translasjonsforskere til å undersøke nye kardioprotektive eller regenerative midler etter hjerteinfarkt i store dyremodeller.
Transepikardial intramyokardial injeksjon
Denne prosedyren har fordelen av direkte hjertevisualisering og har vist seg å gi større lokal retensjon av terapeutika enn systemiske administrasjonsmetoder 9,10,14. Thorakotomier er imidlertid invasive, krever betydelig teknisk dyktighet og gir større risiko for sykelighet og dødelighet enn andre metoder omtalt10,15. Kunnskap om de kritiske og usikre stadiene av prosedyren kan bistå i formidlingen av denne økte risikoen.
Stor forsiktighet må utvises ved manipulering av hjertet for å avsløre hjertets apex på grunn av høy risiko for arytmi og tilhørende hemodynamisk kompromiss. Kontinuerlig invasiv blodtrykksovervåking og elektrokardiografi muliggjør rask identifisering av hypotensjon eller ustabile arytmier, noe som letter rask intervensjon og korreksjon. Forbigående hypotensjon kan vanligvis behandles med metaraminolboluser. Vedvarende hypotensjon kan forbigås ved å redusere bedøvelse av sniffestoffer (nøye overvåking av anestesidybde) og starte en vasopressorinfusjon, samtidig som årsaken til endret hemodynamikk påbegynnes. Ustabile arytmier, som ventrikulær takykardi eller ventrikkelflimmer, kan behandles med elektrisk kardioversjon med eller uten intravenøs antiarytmika.
Like viktig for dyrs overlevelse er vellykket fjerning av fri gass fra pleurhulen før du lukker brystet. Unnlatelse av å gjøre dette kan kulminere i å utvikle en pneumothorax, slik at dyret har stor risiko for respiratorisk kompromiss og død når det er koblet fra den mekaniske ventilatoren ved gjenoppretting. Positivt luftveistrykk må opprettholdes i minst 30 s til bobler ikke lenger observeres. Silikonslangen fjernes umiddelbart når boblen opphører, og brystkassen lukkes deretter raskt. Det er også mulig å kirurgisk plassere et torakostomirør ved lukking, slik at manuell luft og inflammatorisk væskefjerning i løpet av de neste 24-72 timene. Dette er imidlertid vanskelig å holde rent og intakt, spesielt hvis dyr er plassert sammen. Skader eller forurensning av røret kan føre til pyothorax, pneumothorax eller sepsis. Vår erfaring er at det ikke er nødvendig å legge inn et midlertidig brystdren dersom fri gass fjernes tilstrekkelig før brystet lukkes.
Perkutan transendokardial intramyokardial injeksjon
Denne metoden for terapeutisk administrasjon har fordelen av å tillate lokal vevslevering med lavere risiko på grunn av sin mindre invasive natur sammenlignet med en kirurgisk tilnærming10,14. Denne teknikken er allerede brukt i store dyreforsøk, med både fluoroskopi og elektromekanisk kartlegging som en veiledning i fravær av direkte visualisering10,16,17.
Gitt at hjertet ikke er under direkte syn, er det forsvarlig for prosedyremannen å bruke ortogonale fluoroskopiske synspunkter når de velger et injeksjonssted. Videre er injeksjon av fortynnet jodkontrast før og levering av terapeutisk ekstremt verdifull for å bekrefte myokardkontakt. Passende kontakt kan bekreftes ved å observere en karakteristisk “myokardial rødme”, som kan være en av de eneste markørene for injeksjonssuksess før vevshøsting. På grunn av risikoen for kammerperforering anbefales også myokardveggtykkelsen på det valgte injeksjonsstedet å være større enn 9 mm14,16.
Jugulær venøs osmotisk minipumpe
Den osmotiske minipumpen er en populær enhet som vanligvis brukes i små dyreforsøk. Det har vært økende interesse for å bruke denne enheten i store dyremodeller 7,18,19, gitt sin unike fordel ved å administrere et terapeutisk middel med en konsistent hastighet over en bestemt tidsperiode. En mulig begrensning av denne metoden er manglende evne til å endre eller stoppe infusjonshastigheten av legemidlet uten å erstatte eller fjerne pumpen. Dette bør vurderes før du prøver behandling på denne måten.
Denne studien viste at denne metoden kunne utføres med høy suksessrate hos svin, med lav sykelighet og dødelighet. Det må bemerkes at mange vitale strukturer ligger ved siden av operasjonsstedet, inkludert lymfeknuter, thymus og halspulsåren. Overholdelse av metoden, og konsultasjon av anatomiske tekster20, anbefales sterkt for å forhindre utilsiktet skade på noen av disse strukturene. Den mest bekymringsfulle komplikasjonen av denne metoden er hemorragisk sjokk på grunn av utilsiktet skade på halsvenen eller en omgivende struktur. Det er derfor viktig at bløtvevet rundt halsvenen fjernes forsiktig. Hvis du ikke fullfører dette trinnet på riktig måte, kan det føre til vanskeligheter med å plassere minipumpeslangen eller kontrollere utilsiktet blødning.
Denne artikkelen har beskrevet tre metoder for levering av kardioaktive terapier. Til tross for den rapporterte suksessen til hver teknikk, er det iboende begrensninger som skal vurderes. Invasive prosedyrer (transepikardial injeksjon) tillater økt nøyaktighet av terapeutisk levering; Imidlertid gir de større risiko for potensielt dødelige komplikasjoner. Videre har invasiv levering et større krav til tekniske ferdigheter for å minimere risikoen for komplikasjoner. Tilsvarende krever fluoroskopisk-guidet, transendokardial injeksjon en grad av teknisk ferdighet for kateterisering og manipulering av maskinvare. Hvis denne metoden utføres feil, er injeksjonssvikt og dødelige komplikasjoner mulig.
De direkte injeksjonsmetodene som er beskrevet, tillater engangsadministrering av en terapeutisk i målvevet. Den jugularvenøse osmotiske minipumpen tillater systemisk administrering av en terapeutisk over en 7-dagers periode. Til sammenligning er denne metoden enklere og forbundet med mindre risiko, men den er avhengig av at en systemisk terapeutisk finner veien til myokardiet. I tillegg, når pumpen er på plass, er det umulig å avbryte administrasjonen eller endre dosehastigheten uten å bedøve dyret på nytt og fjerne pumpen.
Alle metodene beskrevet i denne artikkelen ble utført på dyr på dagen eller 2 uker etter hjerteinfarkt. Derfor kan dette arbeidet ikke rapportere suksessen til nevnte metoder hos friske dyr eller dyr utsatt for en alternativ hjertepatologi. Til slutt skal farmakologien og bioteknologien til ethvert tiltenkt middel vurderes nøye, da dette vil være iboende knyttet til effekten av den valgte leveringsveien. En detaljert diskusjon av dette er utenfor rammen av dette manuskriptet.
Omfattende skildringer av prekliniske metoder gagner dyrevelferden og det bredere vitenskapelige samfunnet. Den resulterende forbedrede reproduserbarheten av prosedyrer og resultater fører til færre dyrehelsekomplikasjoner, redusert antall dyr som kreves for å produsere signifikante resultater, og større tillit til eksperimentelle resultater21,22. Tre administrasjonsmetoder for nye terapier er beskrevet i denne artikkelen for behandling av hjerteinfarkt i en svinemodell. Ved å detaljere teknikkene som brukes og artikulere fordelene og risikoen for hver, forventes det at forskere komfortabelt vil kunne skape konsistente og pålitelige prekliniske modeller som passer deres forskningsmål.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble finansiert av tilskudd fra National Health and Medical Research Council APP1194139 / APP1126276 (JC), National Stem Cell Foundation of Australia og New South Wales Government Office of Health and Medical Research (JC). DS ble støttet av Royal Australasian College of Physicians, Institute of Clinical Pathology and Medical Research og Australian Government Research Training Program. TD ble støttet av Institute of Clinical Pathology and Medical Research, Penfolds Family Scholarship, National Health and Medical Research Council (APP2002783) og National Heart Foundation of Australia (104615).
Central line placement | |||
2-0 sutures | Ethicon | JJ9220 | |
Arrow' Paediatric Two-Lumen Central Venous Catheterisation Set with Blue FlexTip Catheter (contains 18G cook needle and 0.035" J-tip wire) | Teleflex | CS-14502 | Central Line |
Green Fluorsence Protein (GFP) | Abcam | ab13970 | 1:100 dilution ratio |
Histology antibodies | |||
Ku80 | Cell Signalling Technology | C48E7 | 1:500 dilution ratio |
No. 11 scalpel | Swann-Morton | 203 | |
Sparq' Ultrasound System | Philips | MP11742 Medpick | |
Sterile ultrasound probe cover | Atris | 28041947 | |
Swine Jacket with Pocket, size 'Medium' | Lomir Biomedical | SS J2YJJET | |
Jugular vein osmotic minipump implantation | |||
Adson Brown Tissue Forceps | Icon Medical Supplies | KLINI316012 | |
Bellucci Self-Retaining Retractor | surgicalinstruments.net.au | group-24.26.02 | Self retaining tissue retractor |
Electrosurgical Pencils with 'Edge' Coated Electrodes | Covidien | E2450H | Cautery Pencil |
Metzenbaum Scissors | Icon Medical Supplies | ARMO3250 | |
No. 22 scalpel blade | Swann-Morton | 208 | |
Nylon Suture (2-0, 3-0) | Ethicon | D9635, 663G | |
Osmotic Infusion Minipump | Alzet | 2ML1, 2ML2, 2ML4 | |
Vascular Silicone Ties | Vecmedical | 95001 | |
Vicryl suture (5-0) | Ethicon | W9982 | |
Percutaneous transedocardial injection | |||
Artis Zee' C-Arm Fluoroscopy | Siemens | IR-19-1994 | |
CARTO' 3 System | Biosense Webster | Electrophysiological Mapping Software & System | |
Cook Access Needle | Cook Medical | G07174 | Cannulation needle |
Fast-Cath' Introducer (6 French, 8 French) | Abbott | 406204, 406142 | Vascular sheath with introducer and guidewire |
Myostar' Injection Catheter | Biosense Webster | 121117S, 121119S, 1211120S | Intramyocardial injection catheter |
No.11 scalpel | Swann-Morton | 203 | |
Omnipaque' Iohexol Contrast | GE Healthcare | AUST R 39861 | Iodinated contrast agent |
Sparq' Ultrasound System | Philips | MP11742 Medpick | |
Sedation & general anaesthesia | |||
Compound Sodium Lactate Hartmann's Solution | Free flex | 894451 | |
Fentanyl 50 mcg/mL | Pfizer | AUST R 107027. | Intravenous anaesthesia and analgesia |
Forthane' Isoflurane | Abbott | AUST R 29656 | Inhalant anaesthetic |
GE Aestiva 5 Anaesthesia Machine | Datex Ohmeda | 17002-9, 17002A9 Avante Health Solutions | Anaesthetic Machine |
Hypnovel' Midazolam 5 mg/mL | Roche | AUST R 13726 | Sedative |
Intravenous cannula | BD Angiocath | 381137 | 20 gauge cannula |
Ketamil' Ketamine 10 mg/mL | Ilium | APVMA number: 51188c | Sedative |
Laryngoscope | Miller | VDI-6205 | |
Medetomidine 1 mg/mL | Ilium | APVMA number 64251; ACVM number A10488 | Sedative |
Metaraminol 10 mg/mL | Phebra | AUST R 284784 | Short-acting vasopressor |
Methadone 10 mg/mL | Ilium | APVMA number: 63712 | Sedative, Restricted drug |
Onsetron' Ondansetron 2 mg/mL | Accord Healthcare | AUST R 205593 | Anti-emetic |
Propofol-Lipuro' Propofol 10 mg/mL | Braun | AUST R 142906 | Intravenous anaesthetic |
Pulse Oximeter | Meditech | GVPMT-M3S | Portable pulse oximeter |
Shiley' Cuffed Basic Endotracheal Tube (Size 5.5 & 6.0) | Medtronic | 86108-, 86109- | |
Shiley' Intubating Stylet, 10 Fr | Medtronic | 85864 | |
Sodium Chloride 0.9% | Free flex | FAH1322 | |
Thoracotomy and epicardial Cell Injection | |||
27 G Insulin needle | Terumo | 51907 | |
Adson Brown Tissue Forceps | Icon Medical Supplies | KLINI316012 | |
CARTO' 3 System | Biosense Webster | Electrophysiological Mapping Software & System | |
Cefazolin 1 g Vial | AFT Pharmaceuticals | 9421900137367 CH2 | Antibiotic Prophylaxis |
Chest drainage tube | SurgiVet | SKU-336 | |
Cook Access Needle | Cook Medical | G07174 | Cannulation needle |
Cooley Sternotomy Retractor Paediatric | Millennium Surgical | 9-61287 | |
Durogesic' 100 mcg/h Fentanyl Patch | Janssen | AUST R 112371 | Postoperative analgesia |
Electrosurgical Pencils with 'Edge' Coated Electrodes | Covidien | E2450H | Cautery Pencil |
Electrosurgical Pencils with 'Edge' Coated Electrodes | Covidien | E2450H | Cautery Pencil |
Fast-Cath' Introducer (6 French, 8 French) | Abbott | 406204, 406142 | Vascular sheath with introducer and guidewire |
Lignocaine 20 mg/mL | Pfizer | AUST R 49296, AUST R 49297, AUST R 49293 and AUST R 49295. | Local anaesthesia, anti-arrhythmic |
Marcaine' Bupivacaine 0.5% | Pfizer | AUST R 48328 | Local anaesthesia. |
Metzenbaum Scissors | Icon Medical Supplies | ARMO3250 | |
No. 22 scalpel | Swann-Morton | 208 | |
Nylon Suture (2-0, 3-0) | Ethicon | D9635, JJ76264 | |
Size 1 PDS suture | Ethicon | JJ75414 | |
Sparq' Ultrasound System | Philips | MP11742 Medpick | |
Sterile gauze | Kerlix | KE5072 | |
Sterile laparotomy sponges | Propax | 2907950 | |
Thermocool Smartouch' Catheter | Biosense Webster | D133601, D133602, D133603 | Epicardial Mapping Catheter |