태아 조직 유래 장내 투과성 테스트

인체 조직 수집은 워싱턴 대학교 기관 검토 위원회(연구 ID: STUDY380 및 CR ID: CR3603)의 승인을 받았으며 선천적 결함 연구소에서 수행되었습니다. 선천적 결함 연구소는 유니스 케네디 슈라이버 국립 아동 건강 및 인간 발달 연구소의 NIH 상 번호 5R24HD000836의 지원을 받았습니다. 표본은 동의한 참가자로부터 수집되어 건강 정보 없이 익명화된 것으로 보내졌습니다. 소장 표본은 얼음처럼 차가운 Dulbecco의 인산염 완충 식염수 (DPBS)에 보관하고 밤새 수령 실험실로 우편으로 보냈습니다. 1. 시약 준비 참고: 시약 및 카탈로그 번호 목록은 재료 표를 참조하십시오. 권장 용량은 달리 언급되지 않는 한 6웰 플레이트용입니다. 50 mL의 인산염 완충 식염수(PBS)에 50 mg의 BSA 분말을 100 μg/mL의 광범위 항생제 프리모신과 용해시켜 0.1% 소 혈청 알부민(BSA)을 준비하여 조직 또는 장내 장구와 접촉하는 모든 플라스틱 제품 및 팁을 코팅합니다.BSA로 코팅하려면 여과되지 않은 피펫 팁을 팁을 덮기에 충분한 BSA가 있는 50mL 원뿔형 튜브에 넣거나, 페트리 접시 표면을 덮기 위해 1-2mL의 BSA를 추가하거나, 사용하기 전에 실온에서 최소 20-30분 동안 BSA로 15mL 원뿔형 튜브를 채웁니다. 50mL의 DPBS를 100μg/mL 프리모신 및 50μg/mL 겐타마이신과 혼합하여 DPBS 배지를 준비합니다. 이 배지는 2.5 μg/mL 암포테리신의 유무에 관계없이 준비합니다. 2mL의 오가노이드 성장 배지, 100μg/mL 프리모신, 10μM Y27632 및 2.5μM CHIR99021을 혼합하여 장내 성장 배지를 준비합니다. 매일 신선한 배지를 만들고 37 ° C의 세포 배양 인큐베이터에서 따뜻하게합니다.참고: Y27632의 희석 계수는 1:250입니다. CHIR99021의 경우 CHIR 저장 용액을 따뜻한 배지에서 1:100으로 희석한 다음 장내 성장 배지에서 1:40으로 희석하여 1:4000 희석을 달성합니다. 스톡 기저막 매트릭스 10 μM Y27632 및 2.5 μM CHIR99021을 첨가하여 기저막 매트릭스 믹스를 준비한다. 6웰 플레이트의 한 웰에 대해 8mg/mL 단백질 농도로 총 285μL의 최종 기저막 매트릭스 혼합물을 만듭니다.알림: 기저막 매트릭스는 액체 형태를 유지하기 위해 얼음처럼 차가워야 하며 더 따뜻한 온도에서 응고됩니다. 스톡 기저막 매트릭스의 단백질 농도는 다음 방정식을 사용하여 8mg/mL 최종 단백질 농도를 만드는 데 필요한 부피를 결정합니다.부피 1 × 농도 1 = 부피 2 × 농도 2 PBS의 32% 스톡 PFA를 1:8로 희석하여 4% 파라포름알데히드(PFA)를 준비하고 실온에서 보관합니다. 고정할 엔터로이드의 각 웰에 대해 0.5mL를 만드십시오. PBS에 5% 염소 혈청과 0.5% 트리톤 X-100을 첨가하여 블로킹 완충액을 준비합니다. 웰당 첫 번째 항체에 대해 1mL를 준비하고 웰당 추가 항체에 대해 0.5mL를 준비합니다.참고: 2차 항체의 숙주와 동일한 종의 혈청을 사용하십시오. 각 항체에 대해 제조업체가 권장하는 농도로 차단 완충액에 희석 된 1 차 및 2 차 항체를 준비하십시오. PBS의 1 mg / mL 스톡 용액에서 1 : 200으로 희석하여 5 μg / mL Dmidino-2- 페닐 인돌 (DAPI)을 준비하십시오. 염색 된 엔터 로이드의 웰 당 0.5mL를 만드십시오. PBS에 70% 글리세롤을 준비하고 현미경 슬라이드에 엔테로이드를 장착하기 위해 0.5mL를 만듭니다. PBS에서 25mg/mL 스톡 용액을 1:5 비율로 희석하여 5mg/mL 덱스트란-FITC(플루오레세인-이소티오시아네이트)를 준비합니다. 미세 주입을 위해 20 μL를 만드십시오. PBS에서 LPS 분말을 5mg/mL 스톡 용액으로 재구성하여 지질다당류(LPS) 및 덱스트란-FITC를 제조합니다. PBS 중 LPS 및 덱스트란의 스톡 용액을 0.1 mg/mL 및 0.5 mg/mL LPS 및 5 mg/mL 덱스트란-FITC로 희석합니다. 미세 주입을 위해 20 μL를 만드십시오. EGTA 분말을 증류수에 녹여 0.2M의 원액을 만들고 염산(HCl)을 사용하여 pH를 약 8로 조정하여 에틸렌글리콜비스(β-아미노에틸에테르)-N,N,N’,N’-테트라아세트산(EGTA)을 제조한다. 1:100 희석을 수행하여 배양 배지에 2 mM의 시험 농도를 준비한다. 2. 검체 채취 샘플이 수신되면 샘플 수집 후 24시간 이내에 상피 세포 분리 및 도금을 수행합니다. 3. 전체 표본의 기저막 매트릭스의 장 상피 세포 도금 참고 :이 절차는 미시간 대학교12,13,14의 번역 조직 모델링 실험실에서 수정 된 프로토콜을 따릅니다. Wnt 인자 중 성장 배지를 사용하면 장내 형성에 대해 일관된 결과를 얻을 수 있습니다. 엔테로이드가 설정되면 Wnt 계수가 높은 동일한 매체를 사용하여 엔테로이드를 미세 주입을 위해 구형으로 구동합니다. 장 부분을 암포테리신이 함유된 얼음처럼 차가운 DPBS가 있는 60mm x 15mm 페트리 접시에 옮기고 얼음에 20분 동안 담근다. 조직이 흡수되는 동안 소장의 영역 (십이지장, 공장 또는 회장)을 확인하고 집게와 가위로 결합 조직과 혈관을 제거하십시오. 상피를 방해하지 않고 작은 23-25G 바늘과 3mL 주사기를 사용하여 필요에 따라 루멘 함량을 씻어냅니다. 메스를 사용하여 장 세그먼트를 3-5mm 조각으로 자르고 얼음에 0.5-1mL의 오가노이드 성장 배지가 들어있는 35mm x 15mm 페트리 접시에 1-2 개 (6 웰 플레이트의 한 웰에 도금 용)를 놓습니다. 해부 마이크로 가위와 집게를 사용하여 장 튜브를 세로로 자릅니다. 집게 팁을 사용하여 10x 실체 현미경으로 근막에서 상피 세포를 긁어냅니다. 근막을 제거하고 접시를 소용돌이 치면 세포 덩어리가 부서집니다. 20μL 피펫 절단 팁을 사용하여 5-10μL 단위로 세포와 배지를 기저막 매트릭스 믹스로 옮겨 8mg/mL 매트릭스 단백질 농도에서 285μL 용액을 만듭니다. 200μL 절단 팁을 사용하여 얼음 위의 기저막 매트릭스에서 세포를 혼합하기 위해 천천히 위아래로 피펫합니다. 5개의 50μL 스트립의 세포 기저막 매트릭스 믹스를 따뜻한 발포 벽돌 위에 보관된 예열된 6-웰 플레이트의 한 웰에 놓습니다. 플레이트를 37°C 및 5%CO2 의 세포 배양 인큐베이터에서 10분 동안 인큐베이션하여 기저막 매트릭스가 중합되고 경화되도록 한다. 2mL의 장내 성장 배지를 응고된 기저막 매트릭스 스트립의 웰에 추가하고 세포 배양 인큐베이터 내부에 다시 넣습니다. 장내 성장을 촉진하기 위해 매일 배지를 교체하십시오. 매일 10x 도립 현미경으로 장 줄기 세포 분화를 확인하십시오. 10-14일 후, 엔테로이드 밀도에 따라 엔테로이드를 12웰 또는 6웰 플레이트의 한 웰에 통과시킵니다. 격일로 미디어를 교체하기 시작하고 엔테로이드가 번성하기 시작하면 5-7일마다 1:2 비율로 통과하십시오.계대 동안 기저막 매트릭스 층을 가진 장내로 분화하지 않는 세포를 제거하십시오. 필요한 경우 80% 성장 배지, 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 10% 디메틸설폭사이드(DMSO)에서 냉동하여 통로가 낮은 냉동 엔테로이드 재고를 만듭니다. 4. 장내 면역형광염색 알림: 고정 및 염색 과정은 3 일이 걸립니다. 이 프로토콜에서는 변형된 프로토콜15를 사용하여 핵(DAPI), 상피 마커(융모, CDX2), 리소자임, 뮤신 및 단단한 접합 단백질(클라우딘 2, 클라우딘 3, 오클루딘, 조눌라 오클루덴-1)에 대해 고정 및 염색했습니다. 형광 이미지는 컨포칼 현미경으로 촬영하였다. 설정알림: 이 과정은 일반적으로 장내 통과 또는 동결 절차와 동시에 수행됩니다.엔터 로이드 플레이트를 얼음 위에 놓습니다. 성장 배지를 제거하고 차가운 DPBS로 2x 부드럽게 씻으십시오. 고정되고 염색 될 엔터 로이드를 확인하십시오. 200μL 절단 팁으로 조심스럽게 피펫팅하거나 1μL 접종 루프를 사용하여 12웰 플레이트로 옮깁니다. 다른 항체로 염색해야 하는 경우 엔테로이드를 별도의 웰에 놓습니다. 엔테로이드를 방해하지 않고 200μL 팁으로 가능한 한 많은 액체를 제거하십시오. 0.5mL의 4% PFA를 넣고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 기저막 매트릭스에서 엔테로이드의 분리를 용이하게하기 위해 때때로 플레이트를 소용돌이 치십시오. 기저막 매트릭스에서 엔터 로이드의 분리를 결정하기 위해 총체적으로 검사하십시오. 엔테로이드를 방해하지 않고 액체 PFA를 조심스럽게 흡인하고 폐기하십시오. PBS 3x로 세척하여 PFA 및 잔류 기저막 매트릭스를 제거합니다.알림: 실체 현미경으로 액체를 흡입하면 장형을 피하는 데 도움이 될 수 있습니다. 고정 엔테로이드는 PBS에서 4°C에서 최대 1개월 동안 보관할 수 있습니다. 블로킹엔테로이드를 방해하지 않고 200μL 피펫으로 잔류 PBS를 조심스럽게 제거합니다. 0.5mL의 블로킹 버퍼를 추가하고 실온에서 2시간 동안 배양합니다. 엔테로이드가 손상되지 않도록 주의하면서 200μL 피펫으로 블로킹 버퍼를 제거하고 폐기합니다. 항체 염색엔테로이드가 있는 각 웰에 블로킹 버퍼에 500μL의 1차 항체를 추가합니다. 1차 항체 및 리소자임의 경우 희석 계수는 1:100, CDX2의 경우 희석 계수는 1:100, 빌린의 경우 희석 계수는 1:50입니다. 4°C에서 밤새 배양합니다. 다음날, 항체 용액을 제거하고 PBS로 3x 세척한다. 각 세척에 대해 10-15분의 배양 시간을 허용합니다. 4.3.1.-4.3.2단계를 반복합니다. 희석 계수가 1:400인 2차 항체의 경우. PBS에 5μg/mL의 DAPI 500μL를 추가하고 실온에서 15분 동안 배양합니다. 배양 후 PBS로 3회 세척하고 각 세척에 대해 10-15분의 배양 시간을 허용합니다. 장착가능한 한 많은 PBS를 제거하십시오. 염색 된 엔터 로이드를 70 % 글리세롤 1x로 씻으십시오. 1 μL 접종 루프 또는 절단된 200 μL 팁을 사용하여 플레이트에서 엔테로이드를 들어 올리고 70% 글리세롤로 유리 현미경 슬라이드에 장착합니다. 엔터로이드의 3D 구조를 유지하려면 하단 유리 슬라이드와 커버 슬립 사이에 0.5-1mm의 공간을 확보하십시오. 얇은 실리콘 고무 시트 또는 유리 커버 슬립의 컷 아웃을 사용하여 유리 슬라이드와 커버 슬립 사이에 공간을 만듭니다. 엔테로이드는 이제 컨포칼 현미경으로 이미지화할 수 있습니다. 5. 장내 미세 주사 준비 참고 : 미세 주입 프로토콜은 리소스 및 설정에 맞게 Hill et al.16 에서 수정 된 프로토콜입니다. 일부 준비 단계는 며칠 전에 완료해야합니다. 미세 주입 설정 설정실험의 목적에 따라 다음과 같이 생물 안전 캐비닛 내부 또는 깨끗한 카운터에 마이크로 인젝터 장치를 설치하십시오 : 볼 수있는 실체 현미경, 현미경 옆의 무거운 스탠드에 장착 된 X-, Y 및 Z 축 제어 nob가있는 마이크로 매니퓰레이터, 마이크로 매니퓰레이터 암에 장착 된 마이크로 피펫 홀더, 마이크로 피펫 홀더와 3 방향 스톱 콕이있는 주사기를 연결하는 마이크로 인젝터 튜브, 그런 다음 공압 펌프와 펌프에 연결된 벽 공기 공급원에 연결합니다(그림 1). 실험 사용 전과 후에 70 % 에탄올로 미세 주입 장치를 소독하십시오. 마이크로피펫이 대상 표본에 도달할 수 있도록 축 손잡이를 이동하는 것을 포함하여 원하는 물리적 사양에 맞게 현미경과 마이크로 매니퓰레이터의 위치를 테스트합니다. 마이크로 피펫의 제조참고: 다음 단계를 미리 수행하십시오.마이크로피펫 풀러를 사용하여 유리 모세관을 마이크로피펫으로 당깁니다. 실체 현미경에서 마이크로피펫을 수평 마이크로피펫 홀더(그림 2)에 놓고 팁에 초점을 맞춘 다음 현미경 접안렌즈를 통해 보면서 마이크로 가위를 사용하여 팁을 자릅니다. 각 실험에 대해 비슷한 팁 크기로 약 10-15 개의 마이크로 피펫을 준비하십시오. 0.5-1 μL의 액체를 끌어 올려 팁 크기를 테스트하고 볼륨을 비우는 데 필요한 펌프 수를 세십시오. 여러 팁 크기를 테스트하여 실험에 적합한 크기를 찾습니다. 적절한 팁 크기는 펌프당 약 10-30nL 부피를 배출합니다. 절단된 유리 마이크로피펫을 팁을 손상시키지 않고 깨끗한 상자나 튜브에 보관하십시오.알림: 사전 절단 된 마이크로 피펫은 상업적으로 이용 가능합니다. 장내 준비대부분 크고 구형의 엔테로이드 접시를 얼음 위에 놓습니다. 오래된 성장 배지를 새 배지로 교체하십시오. 세포 리프터를 사용하여 플레이트에서 기저막 매트릭스 도트를 부드럽게 분리합니다. 얼음 위에서 젤 점을 좌우로 소용돌이 치면 엔터 로이드를 방해하지 않고 기저막 매트릭스가 분해됩니다. 실체 현미경으로 20μL 피펫 팁을 절단하여 약 10-15개의 구형 엔테로이드를 선택하고 기저막 매트릭스에 추가하여 285μL의 8mg/mL 단백질 농도 혼합물을 만듭니다. 절단된 200μL 팁으로 부드럽게 위아래로 피펫하여 엔테로이드를 깨뜨리지 않고 혼합합니다. 둥근 35mm x 10mm 세포 배양 페트리 접시 또는 유사한 치수의 접시 중앙에 5개의 50μL 젤 도트를 플레이팅합니다. 엔테로이드 겔 도트를 37°C에서 10분 동안 인큐베이션하여 고형화시킨다. 그런 다음 접시에 신선한 성장 배지 1mL를 추가합니다. 안정화를 위해 그리고 엔테로이드가 0.5-1 μL의 적절한 크기에 도달할 때까지 최소 2-3일 동안 엔테로이드를 배양합니다.알림: 엔테로이드에 쉽게 접근할 수 있도록 벽이 낮은 접시와 적은 양의 성장 배지를 위해 작은 직경을 갖는 것이 중요합니다. 덱스트란-FITC 및 시험된 물질의 미세주입공압 펌프의 3방향 스톱콕을 끕니다. 주입 된 물질 (이 경우 LPS가 있거나없는 덱스 트란 -FITC)로 마이크로 피펫을 채 웁니다. 투명 필름 스트립으로 덮인 페트리 접시를 준비하십시오. 주입된 물질의 1μL 도트 2-4개를 필름에 놓습니다. 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 마이크로 피펫의 끝을 액체 내부로 구동하지만 실체 현미경의 시각화하에 필름 위로 구동합니다. 주사기를 부드럽게 당겨 주입 된 물질을 마이크로 피펫으로 빼냅니다. 마이크로피펫에 2-4μL의 주입된 물질을 채우고 주사기를 밀어 마이크로피펫 끝의 공기를 제거합니다. 마이크로피펫에 주입된 물질 컬럼을 검사하여 공기 주머니가 없는지 확인합니다. 마이크로 피펫 내부에서 철수 한 주입 된 물질의 양을 기록하십시오.알림: 액체는 덱스트란-FITC로 인해 녹색으로 보입니다. 약 60psi의 공기 압력을 제공하는 공압 펌프에 연결된 공기 공급원을 켭니다. 펌프를 켜고 펌프 지속 시간을 10-15ms로 설정하십시오. 주사기의 스톱 콕을 돌려 펌프에서 마이크로 피펫까지의 라인을 엽니 다.알림: 펌프 지속 시간이 길수록 펌프당 더 많은 재료가 방출될 수 있습니다. 주입 된 부피를 추정하기 위해 전체 실험에 대해 동일한 펌프 지속 시간과 팁 크기가 유사한 마이크로 피펫을 사용하는 것이 좋습니다. 세포 배양 인큐베이터에서 엔테로이드를 제거하고 미세 주입 후 빛 노출을 제한하기 위해 덮인 용기에 담긴 따뜻한 거품 벽돌 위에 접시를 놓습니다. 엔테로이드가 있는 페트리 접시를 실체 현미경 아래에 놓고 마이크로 매니퓰레이터 손잡이를 움직여 마이크로피펫 끝을 수평 표면에 대해 약 35°-45° 각도로 놓습니다(그림 3). 이것은 사전에 약간의 연습이 필요합니다. 현미경으로 각 페트리 접시의 엔테로이드를 시각화하고 매핑하여 접시당 약 3-5개의 구형 엔테로이드를 주입할 계획을 세웁니다. 마이크로피펫의 끝이 액체 표면에 가까워지면 현미경 접안렌즈를 들여다보고 팁을 표적 엔테로이드 쪽으로 전진시킵니다. 정확한 느린 움직임을 사용하여 z축 손잡이를 전진시켜 마이크로피펫 팁으로 엔터로이드에 구멍을 뚫습니다. 엔터로이드 벽은 팁이 엔터로이드 표면을 통과하면 눌리고 다시 튀어나오며, 이 시점에서 전진이 멈춰야 합니다. 한 발로 펌프 페달을 두드리고 약간 팽창 할 때까지 녹색 덱스트란 -FITC 용액으로 엔터 로이드를 채 웁니다. 펌핑 된 부피와 덱스 트란 농도를 계산하기 위해 펌프 수를 기록하십시오. 미세 주입을 마친 후 마이크로 피펫의 끝을 빼고 다음 엔터 로이드로 이동하십시오. 연습을 통해 프로세스가 원활하게 진행될 수 있습니다.팁이 파손되면 팁 크기가 비슷한 다른 마이크로 피펫으로 교체하십시오. 동일한 노출 그룹의 모든 엔테로이드에 대해 충분한 양의 주입된 재료를 당기고 교차 오염을 방지하기 위해 주입된 재료 간에 마이크로피펫을 교체합니다. 빛에 노출되지 않도록 주입된 장용 접시를 덮개 아래에 놓습니다. 덱스트란-FITC 수집 및 측정미세 주입 절차 후 즉시 배양 배지를 제거하십시오. 신선한 성장 배지로 2x 세척하여 잔류 덱스트란-FITC를 제거합니다. 새 배지를 추가하고 미세 주입 후 시간 0으로 시간을 기록합니다.알림: 미세 주입 과정을 방해하지 않고 이 단계를 수행하려면 두 번째 사람이 필요할 수 있습니다. 불투명한 0.5mL 미세원심분리 튜브에 200μL의 배양 배지를 수집한 다음 제거된 배양 배지를 미세 주입 후 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 8시간, 10시간 및 12시간에 동일한 부피의 신선한 성장 배지로 교체합니다.참고: 시간 간격은 실험에 따라 다를 수 있습니다. 기저측 노출의 경우 교체 매체에는 동일한 농도의 노출이 포함되어야 합니다. 수집된 배양 배지를 4°C에 보관하고 24시간 이내에 덱스트란 농도를 측정합니다. 다른 분석을 위해 남은 배지를 -80°C에 보관하십시오. 배양 배지 수집이 끝나면 필요한 경우 RNA 추출 또는 이미징을 위해 엔테로이드를 수확합니다. 형광 마이크로플레이트 리더로 덱스트란-FITC 농도를 측정합니다. 직렬 희석을 사용하고 그림 4와 같이 선형 회귀선을 피팅하여 각 플레이트에 대한 표준 곡선을 구성합니다. 덱스트란이 없는 신선한 성장 배지로 대체된 덱스트란을 함유하는 배양 배지의 제거된 부피에 대한 흡광도를 다음과 같이 보정한다: 배양 배지 2 mL 중에서 200 μL의 제거는 10 부피%이다.2h에서의 보정된 흡광도 = (1h에서의 흡광도 x 10%) + 2h에서의 측정된 흡광도제1 보정된 배지의 흡광도는 보정이 필요하지 않습니다. 그런 다음 표준 곡선 방정식을 사용하여 보정된 흡광도 값으로부터 덱스트란 농도를 계산합니다. 정규화를 위해 덱스트란 농도를 각 페트리 접시의 총 펌프 수로 나눈 다음 접시당 최대 총 펌프 수를 곱합니다.알림: 모든 노출은 3 배로 수행됩니다 (노출 당 3 개의 페트리 접시와 접시 당 3-5 개의 미세 주입 엔테로이드). 삼중 평균값은 스튜던트 t-검정을 사용하여 노출 간에 비교됩니다.