このプロトコルは、胎児の腸組織からの3次元腸モデルであるエンテロイドの確立を詳述しています。上皮バイオマーカーの免疫蛍光イメージングをモデルの特性評価に使用しました。細菌性エンドトキシンであるリポ多糖の頂端曝露は、マイクロインジェクション技術を用いて、蛍光デキストランの漏出によって測定される用量依存的に上皮透過性を誘導した。
ヒト胎児組織由来エンテロイドは、早産児の腸管損傷を研究するための有望な in vitro モデルとして浮上しています。エンテロイドは極性を示し、頂端境界を有する内腔、タイトジャンクション、および成長培地に露出した基底外側外層からなる。腸管損傷の結果には、粘膜の炎症と透過性の増加が含まれます。脆弱な早産のヒト被験者における腸透過性の試験は、しばしば実行不可能である。したがって、早産児の腸管損傷を研究するには、 in vitro 胎児組織由来腸モデルが必要です。エンテロイドは、タイトジャンクションタンパク質によって調節される上皮透過性の変化を試験するために使用できます。エンテロイドでは、腸幹細胞はすべての上皮細胞型に分化し、マウス肉腫細胞から分泌される基底膜マトリックス上に立体構造を形成します。本稿では、胎児の腸組織からエンテロイドを樹立し、免疫蛍光イメージングで腸内タイトジャンクションタンパク質を特徴付け、上皮透過性をテストするために使用される方法について説明します。グラム陰性優性菌嚥下障害は腸管損傷の危険因子として知られていることから、グラム陰性菌が産生するエンドトキシンであるリポ多糖(LPS)を用いてエンテロイドの透過性を誘導した。フルオレセイン標識デキストランを腸管腔にマイクロインジェクションし、培地に漏出した連続デキストラン濃度を測定して、傍細胞透過性の変化を定量化しました。実験は、LPSへの頂端曝露が濃度依存的に上皮透過性を誘導することを示した。これらの知見は、グラム陰性優性嚥下障害が早産児の腸管損傷のメカニズムに寄与しているという仮説を支持している。
早産児は頻繁かつ長期にわたる炎症にさらされるため、腸の損傷のリスクが高まり、長期的な障害や死亡につながります1。この分野の研究は、脆弱な早産児で実験を行う能力が限られていることに挑戦しています。さらに、適切なモデルの欠如は、早期腸環境の包括的な研究を妨げています2。既存のin vitroおよびin vivoモデルは、早期のヒト腸内環境を包括的に表現することができませんでした。具体的には、単一の上皮胎児細胞株はタイトジャンクションを形成しない可能性があり、動物モデルはヒト早産児とは異なる炎症性および免疫学的応答を示します。腸管陰窩幹細胞の増殖と分化における主要な経路としてのWntシグナル伝達と新規Lgr5+組織幹細胞の発見により、エンテロイドやコロノイドなどの腸組織由来オルガノイドがin vitroモデルとして確立されました3,4,5。この技術を用いて、腸の全組織または生検から開発された3次元(3D)腸内モデルを作成して利用し、腸内環境に対する上皮応答を研究することができます6,7。
培養で増殖する典型的な腸細胞株とは対照的に、エンテロイドはタイトジャンクションタンパク質8によって接続された内腔を有する極性を示す。これにより、成長培地中の基底外側境界への曝露、ならびに頂端境界を評価するための管腔マイクロインジェクションが可能になります。さらに、エンテロイドは、ヒト上皮と同様の遺伝的、生理学的、および免疫学的特徴を示す9,10。胎児組織由来エンテロイドは、上皮機能に対する未熟児の役割の検査を可能にする。エンテロイドのユニークな特徴は、早産の腸内環境により近い可能性があります9。組織由来エンテロイドは、単層形態として、または固化した基底膜タンパク質混合物に埋め込まれた3D構造として、タイトジャンクションの完全性を試験するために使用できます。頂端曝露が望まれる場合、後者の形態にはマイクロインジェクション技術が必要である。エンテロイドモデルにおける上皮応答の測定には、RNAシーケンシングによる遺伝子発現、酵素結合イムノアッセイ(ELISA)によるバイオマーカー、または高度なイメージング技術が含まれます。ここで紹介する手法は、蛍光測定で総透過性を測定するための別の実行可能なオプションを提供します。
早産児の腸管損傷には、腸内微生物群集の不均衡を含む多因子性病因があります。エンテロイドは、上皮機能を伴う壊死性腸炎などの早産腸疾患の特定の側面を研究するための優れたモデルを提供することができます11。エンテロイドは、ヒト胎児腸と同様の特徴を示す10。エンテロイドをグラム陰性菌によって産生されるエンドトキシンであるリポ多糖(LPS)に基底外側曝露として培地中に曝露すると、炎症の増加と腸透過性につながる可能性のある遺伝子発現が誘導されます7。この研究は、LPSなどの細菌製品への頂端曝露後の総上皮透過性の変化を評価することを目的としています。この結果は、腸管損傷の病因に関与する微生物と上皮の相互作用に関する手掛かりとなる可能性がある。総透過性をテストするために設計された方法には、マイクロインジェクションのセットアップとスキルが必要です。
このプロトコルでは、胎児の腸組織からのエンテロイドの樹立、および免疫蛍光染色および上皮透過性試験によるモデル特性評価について詳しく説明します。エンテロイドの透過性を、マイクロインジェクション技術および培地中の漏出デキストラン-FITC濃度の連続経時変化測定を用いて試験した。このプロトコルの新規性は、培養培地7における基底外側曝露と比較して、ヒト腸生理学により近い頂端曝露である。以前の研究では、Hillらは、連続画像化および経時的な蛍光強度の計算を利用した16。Aresらは、上皮モデルの基底外側膜をLPSに曝露し、細胞遺伝子発現パターン7を比較しました。比較として、試験した試薬の頂端曝露を使用し、培地中の漏れたデキストランの連続濃度を測定することにより、総透過性の潜在的な変化を調べます。また、培地中の上皮細胞が産生するサイトカインや、細胞のmRNAを収集することで遺伝子発現を連続的に比較することができます。LPSは、透過性および炎症を誘発する能力があるため、動物およびin vitroモデルにおける腸管損傷の研究に一般的に使用されています7,17。このモデルでLPSを試験したところ、上皮透過性は曝露濃度によって区別された。このプロトコルは、異なるマイクロインジェクション材料および結果測定を使用して他の疾患病理を研究するために拡張することができる。
このプロトコルの重要なステップには、胎児の腸組織からのエンテロイドの確立、腸管の特性評価、およびマイクロインジェクション技術が含まれます。この研究の完全性は、正確な細胞サンプリングに依存します。解剖学的ランドマークと血管を使用することは、小腸細胞の選択を確実にするのに役立ちます。胎児の腸幹細胞の強力な増殖と分化のために、他の上皮細胞から幹細胞を分離するための広範な手順は必要ありません。エンテロイドが樹立されたら、タンパク質や細胞マーカーを染色してモデルの特徴を確認することが重要です。このプロトコールでは、エンテロイドを、ビリンおよびCDX2を用いて腸細胞、リゾチームを用いてPaneth細胞、およびムチンを用いて杯細胞について染色し、小腸上皮内に見出される全ての細胞18、19、20について染色した。1つの細胞型を示す従来の単一細胞株とは対照的に、エンテロイドは腸前駆幹細胞からすべての細胞型を確立します8。このプロトコルの染色部分は、目的の特定の細胞マーカーに対して変更することができる。このプロトコルの信頼性にとって重要なのは、マイクロインジェクション技術です。マイクロピペットチップの一貫性は、デキストランFITC溶液を使用してポンプあたりの容量を測定し、顕微鏡下でチップの直径を視覚化することで確認できます。汚染のリスクがあるため、同じマイクロピペットを複数の曝露に使用することはできません。さらに、エンテロイドの形状と成長は、それらの成長培地の内容によって影響を受ける可能性があります。カリフラワー型エンテロイドよりも球形のエンテロイドがマイクロインジェクションのより良いモデルを提供することがわかりました。球状形状は、媒体21におけるより大きなWnt係数によって誘導され得る。
このプロトコルは、特に時間に敏感な測定において、変動を減らすためのマイクロインジェクションにおける実行者のスキルに大きく依存します。同じ経験豊富なパフォーマーを一貫した技術で使用し、同じ細胞起源を使用して遺伝的変異を回避し、同じ継代でテストして成熟度バイアスを除去し、同様の細胞分化のために同じタイプの培地で細胞を増殖させることで、変動を最小限に抑えることができます。増殖培地の成分は、インビボ環境中ではなくインビトロで幹細胞の様々な分化を誘導し得る。例えば、インビボでは、リゾチームは、Paneth細胞が形成されて機能的になる妊娠発達の22〜24週まで発現しない22。しかし、10週目の胎児腸から樹立したエンテロイドからリゾチームを検出することができました。この方法は、マイクロインジェクションに必要な高度な技術的スキルにより、一度にテストされる露光の数を制限することができます。マイクロインジェクション穿刺孔からのデキストラン漏れは、透過性の評価に影響を与える可能性があります。この影響を排除するために、マイクロインジェクションの直後のトリプル洗浄が、手順から残留デキストランを除去するために推奨されます。培地中のデキストラン濃度は、マイクロインジェクション後4〜6時間毎に測定する必要があります。.注射後2〜4時間以内にデキストラン濃度が大幅に上昇した実験は、最終分析から除外する必要があります。.
この方法にはいくつかの利点があります。トランスウェル上のエンテロイド由来の単分子膜と比較して、必要なコストとリソースが少なくて済みます。さらに、生きた細菌やウイルスなどの他の曝露に拡張して、腸内微生物と上皮の間の最初の相互作用を研究することができます。腸管の密閉された内腔は、増殖培地13の汚染なしにマイクロ注入された生細菌の安定した増殖を維持することができる。成長培地やインキュベーション酸素にさらされる単層とは異なり、密閉された内腔は狭く隔離された空間です。密閉された内腔は、増殖培地への連絡を許さず、生細菌の増殖とともに時間の経過とともに低くなる管腔酸素含有量を可能にします13。
胎児の腸組織の使用は、成人の腸幹細胞または動物モデルと比較して早産児の腸上皮をより正確に描写します7。さらに、エンテロイドの極性は、頂端および基底外側の両方の曝露および測定を可能にする23。エンテロイドは、より低い酸素化濃度を有する密閉された内腔を形成し、これは腸24の酸素化濃度をより厳密に模倣する。より技術的に進んだプロトコル16とは対照的に、グロスメディア測定の使用は、この技術のより大きなアクセス可能性を可能にする。実験は、上皮漏出がLPSへの頂端曝露によって誘発される可能性があり、濃度に依存することを示しました。この方法は、デキストランのリーク濃度の変化を調べるため、タイトジャンクションの全体的な機能変化を検出するのに役立ちます。メッセンジャーRNAの収集と露出したエンテロイドのシーケンシング、およびウェスタンブロット分析は、全体的な機能変化の分析を補完することができます。このモデルは、早産環境に非常によく似たシステムで腸上皮の完全性を研究しているため、早産の腸の損傷やその他の病気の病状をよりよく理解するために使用できます。
The authors have nothing to disclose.
胎児組織を共有してくれたイアン・グラス博士とワシントン大学の先天性欠損症研究所の職員に感謝します。また、ミシガン大学のトランスレーショナルティッシュモデリングラボのマイケルデイム博士とジェイソンスペンス博士には、プロセス全体を通しての無限のサポートと指導に感謝します。
Amphotericin 250 uL/mL | Gibco | 15-290-026 | |
Anti-CDX-2 [CDX2-88] 0.5mL concentrated Mouse, IgG, monoclonal | Biogenex | MU392A-5UC | |
Anti-Claudin 2 antibody (ab53032) | abcam | ab53032 | |
Anti-Claudin 3 antibody (ab15102) | abcam | ab15102 | |
Anti-LYZ antibody produced in rabbit | Millipore Sigma | HPA066182-100UL | |
Anti-Mucin 2/MUC2 Antibody (F-2): sc-515032 | Santa Cruz | sc-515032 | |
Anti-Villin, Clone VIL1/4107R 0.5mL concentrated Rabbit, IgG, monoclonal | Biogenex | NUA42-5UC | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Millipore Sigma | A8806 | |
Cell culture plates, CytoOne 12-well non-treated plates | USA Scientific Inc | 50-754-1395 | |
Cell culture plates, CytoOne 6-well non-treated plates | USA Scientific Inc | 50-754-1560 | |
Centrifuge with 15 mL tube buckets | Eppendorf | 05-413-110 | |
CHIR 99021 | Tocris Bioscience | 4423 | |
Confocal microscope | Olympus FV1200 | N/A | Or a similar microscope |
Conical centrifuge tubes, 15 ml | Falcon | 05-527-90 | |
Cover glass for microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-DP | |
Disposable scalpels | Mopec | 22-444-272 | |
Dmidino-2-phenylindole (DAPI) Solution (1 mg/mL) | Fisher Scientific | 62248 | |
Dulbecco's Phosphate-buffered Saline (DPBS, 1X) | Fisher Scientific | AAJ67802K2 | |
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid tetrasodium salt (EGTA) | Millipore Sigma | E8145-10G | |
Fluorescein isothiocyanate dextran (Dextran-FITC) 4 kDa | Millipore Sigma | 46944 | |
Fuorescence microplate reader | Agilent BioTek | Synergy HTX | |
Gentamicin 50 mg/mL | Gibco | 15-750-060 | |
Glass capillary tubes, single-barrel borosilicate, 1×0.5mm, 6" (cut in half before pulling) | A-M systems | 626500 | |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 594 | Fisher Scientific | A32742 | |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Fisher Scientific | A32731 | |
Goat Serum | Fisher Scientific | 16210064 | |
ImageJ software | NIH | N/A | https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) | Stem Cell Technologies | 06010 | |
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4 | Millipore Sigma | L4391-1MG | |
Magnetic stand | World Precision Instruments | M10 | |
Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free, 10 mL | Corning | 354234 | protein concentration > 9 mg/mL preferably |
Micro forceps | Fisher Scientific | 13-820-078 | |
Micro scissors | Fisher Scientific | 08-953-1B | |
Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301 | |
Micropipette puller | World Precision Instruments | SU-P1000 | Or a similar equipment |
Microscope slides | Fisher Scientific | 22-034486 | |
Occludin Polyclonal Antibody | Fisher Scientific | 71-1500 | |
Paraformaldehyde 32% aqueous solution | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | RT 15714 | |
Petri Dishes, 35×10 mm | Fisher Scientific | 150318 | |
Petri Dishes, 60×15 mm | Fisher Scientific | 12-565-94 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | 10010031 | |
PicoPump foot switch | World Precision Instruments | 3260 | |
Pipette tips, non-filtered, 1000 uL | Fisher Scientific | 21-402-47 | |
Pipette tips, non-filtered, 20 uL | Fisher Scientific | 21-402-41 | |
Pipette tips, non-filtered, 200 uL | Fisher Scientific | 21-236-54 | |
Pneumatic PicoPump system | World Precision Instruments | SYS-PV820 | or a similar picopump system |
Primocin 50 mg/mL, 10×1 ml vial | InvivoGen | ant-pm-1 | |
Steel base plate | World Precision Instruments | 5052 | |
Stereo microscope | Zeiss stemi 350 | Or a similar microscope | |
ThermoSafe PolarPack Foam Bricks | Sonoco | 03-531-53 | |
Triton X-100 | Millipore Sigma | T8787 | |
Wall air supply | N/A | N/A | |
Y-27632 dihydrochloride | Tocris Bioscience | 1254 | |
ZO-1 Polyclonal Antibody | Fisher Scientific | 61-7300 |