Модели вагинальной колонизации мышей анаэробно выращенными бактериями

Все эксперименты на животных были одобрены и проведены в соответствии с институциональными руководящими принципами и Руководством по уходу и использованию лабораторных животных Калифорнийского университета в Сан-Диего (UCSD, номер протокола: S20057, 2020-далее), а до этого в Вашингтонском университете, Сент-Луис (протокол 20110149, до 2020 года). ПРИМЕЧАНИЕ: В приведенном ниже протоколе используется традиционно выращенная самка C57Bl/ мышей в возрасте 6-11 недель на момент инокуляции. Обратите внимание на информацию о поставщиках и конкретные возрастные диапазоны, используемые ранее в соответствующей цитируемой работе. 1. Препарат и введение β-эстрадиола 17-валерата ПРИМЕЧАНИЕ: β-эстрадиол 17-валерат является канцерогеном и репродуктивным токсином, который может всасываться через кожу 27,28. Изнашивайте надлежащие СИЗ во время обработки порошка и жидкого раствора. Это также водный токсин29; утилизируйте его надлежащим образом в надлежащим образом запечатанном и маркированном контейнере. Фильтр стерилизует до 50 мл кунжутного масла через фильтр 0,22 мкм с использованием 50 мл конической трубчатой вакуумной фильтрующей системы. Открываются только в шкафу биобезопасности для поддержания стерильности. Рассчитайте объем раствора валерата β-эстрадиола, необходимого для эксперимента: 200 мкл на мышь плюс 2-3 мл дополнительно для учета потерь образца во время заполнения шприца (например, эксперимент на 10 мышах требует в общей сложности 4 мл). Рассчитайте количество β-эстрадиола валерата, необходимого для приготовления раствора 5 мг/мл, и взвесьте его непосредственно в трубке с круглым дном объемом 14 мл. Плотно закройте трубку объемом 14 мл и вихрь, чтобы разбить сгустки в порошке (это позволит β-эстрадиола валерату растворяться быстрее). Добавьте стерильно-фильтрованное кунжутное масло в пробирку объемом 14 мл таким образом, чтобы конечная концентрация β-эстрадиола валерата составляла 5 мг/мл. Поместите плотно закрытую трубку объемом 14 мл на ротатор при 37 °C в течение 30-40 мин, пока твердый порошок полностью не растворится. Визуально подтверждают однородность раствора перед инъекцией мышам. Инкубация при 37 °C снижает вязкость кунжутного масла, облегчая его инъекцию. Вводят раствор β-эстрадиола валерата в шприц объемом 1 мл (без иглы). Чтобы сделать это без введения пузырьков, сначала нарисуйте немного раствора, затем аккуратно вытолкните, сохранив кончик шприца в кунжутном масле. Вытягивайте раствор снова медленно, немного выше отметки 100 мкл. Поместите иглу размером 25 Г х 5/8 на шприц. Затем загрунтуйте иглу, медленно выталкивая раствор кунжутного масла, пока он не начнет выходить из кончика иглы. Выталкивайте раствор до тех пор, пока шприц не достигнет отметки 100 мкл. Приготовьте по одному шприцу на мышь. Вводят β-эстрадиола 17-валерат путем внутрибрюшинной инъекции за 48 ч или 72 ч до инокуляции. Вводят каждой мышке 100 мкл 5 мг/мл раствора β-эстрадиола валерата (0,5 мг β-эстрадиола валерата на мышь), как описано ранее22,30. Хранить оставшийся раствор при 4 °С в течение 72 ч до следующей инъекции. Снова вводят раствор β-эстрадиола валерата в день инокуляции, непосредственно перед вагинальной инокуляцией мышей. Снимите раствор с температуры 4 °C и поместите его на ротатор при 37 °C в течение 30 мин перед инъекцией, чтобы кунжутное масло нагрелось и стало менее вязким. Продолжайте инъекции, как описано в шаге 1.7. 2. Приготовление инокулята ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раздел содержит общие этапы приготовления инокулы из анаэробно выращенной стрептомицин-резистентной Gardnerella vaginalis JCP8151B-SmR 24,25,31,32. Все шаги в этом разделе должны быть выполнены в анаэробной камере. Зациклите любые реагенты, включая приготовленный отвар NYC III, агар и PBS, в анаэробную камеру, чтобы уравновесить по крайней мере за 24 часа до использования.ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь использовалась виниловая анаэробная камера, уравновешенная 5% газовой смесью водорода. Внутренняя концентрация кислорода обычно находится на уровне 0 ppm, хотя при циклическом попадании материалов в камеру может наблюдаться низкоуровневое переходное увеличение (10-25 ppm). За два дня до вагинальной прививки выведите гарднереллу из замороженного запаса глицерина на агаровую пластину NYC III в анаэробной камере. Используйте небольшой контейнер (например, пустой ящик для пипетки), заполненный сухим льдом, чтобы запас глицерина был заморожен во время транспортировки в камеру и из нее. За 1 день до вагинальной прививки используйте 5-10 отдельных колоний гарднереллы из пластины для прививки 10 мл отвара NYC III. Дайте жидкой культуре расти в течение ночи в течение 16 ч при 37 °C. Включите вторую аликвоту 1 мл питательной среды, которую оставляют неинокализованной, и инкубируйте ее вместе с инокулированной культурой, чтобы подтвердить, что среда не загрязнена. Приготовьте инокулятив из жидкой культуры, как описано ниже. Выполняйте приготовление инокулята в анаэробной камере как можно больше.Определяют оптическую плотность культуры (OD) путем добавления 200 мкл культуры к 800 мкл свежей среды в кювете 1,5 мл (разбавление 1:5). Используйте спектрофотометр для измерения плотности (OD) разбавленной культуры на длине волны 600 нм (используйте отдельную кювету только со свежими средами в качестве заготовки). Умножьте показания OD на 5, чтобы получить фактический OD600 из 16-часовой культуры. Рассчитайте объем инокулята, необходимый для эксперимента. Например, чтобы заразить 15 мышей инокулятором 20 мкл на мышь, необходимо 15 х 20 мкл = 300 мкл инокулята. Приготовьте примерно на 25% больше инокулята, чем необходимо, поэтому для 15 мышей приготовьте 300 мкл + (0,25 х 300 мкл) = 375 мкл инокулята. Используя OD600 , определенный на шаге 2.4.1., рассчитайте объем культуры за 16 ч, который необходимо раскрутить и повторно суспендировать, чтобы получить OD600 = 5,0 инокулята в объеме, рассчитанном на шаге 2.4.2. Например, если OD600 культуры равен 1,5, а необходимый объем инокулята составляет 375 мкл, то объем культуры, подлежащей раскручиванию, составляет (375 мкл х 5)/1,5 = 1250 мкл. Пипетка объема культуры рассчитана на шаге 2.4.3. в стерильную микроцентрифужную трубку. Гранулируют бактерии центрифугированием при 16 000 х г в течение 1-3 мин. Удалите супернатант и повторно суспендируйте гранулу в анаэробном PBS в объеме, рассчитанном на этапе 2.4.2. Инокулятив теперь будет иметь расчетный OD600 5,0. Если применимо, также подготовьте трубку PBS, которая будет служить в качестве контроля транспортного средства для мышей в неинфицированной контрольной группе. Перед извлечением трубки инокулята из анаэробной камеры подготовьте серию последовательного разведения от 1:10 до 1:10 x 106 в PBS. Точечная пластина 5 реплицирует каждое разбавление на агаровую пластину с использованием многоканальной пипетки для определения КОЕ инокулята. Это предпрививочная КОЕ. 3. Вагинальное предварительное промывание и прививка гарднереллой Подготовьте вагинальное промывание/промывные трубки в анаэробной камере (это можно сделать одновременно с приготовлением инокулята на этапе 2.4.). Пипетка 70 мкл стерильного, анаэробного PBS в 1,5 мл микроцентрифужных пробирок, помеченных номерами мышей. Подготовьте по одной промывочной трубке на мышь. Плотно закройте трубки и выведите их из анаэробной камеры. Выполните вагинальное промывание каждой мыши с 50 мкл анаэробной PBS из отдельных пробирок, приготовленных на этапе 3.1. Эти влагалищные промывания являются промывками перед прививкой и могут использоваться для последующих измерений и анализов.После введения второй инъекции β-эстрадиола валерата (шаг 1.8) поместите каждую мышь поверх клетки или чистой твердой поверхности, которую она может схватить передними лапами. Осторожно захватите среднюю часть хвоста и поднимите так, чтобы задние четвертины были слегка приподняты, а влагалищное отверстие открыто. Используя пипетку и наконечник фильтра p-200, вытяните 50 мкл PBS из промывочной трубки, соответствующей соответствующей мыши. Осторожно вставьте кончик пипетки во влагалищный просвет ~2-3 мм, а пипетку объемом 50 мкл осторожно, 3x-4x. Перенесите собранный моющий материал (~ 50 мкл) обратно в ту же промывочную трубку, из которой он пришел, пипетируя вверх и вниз в промывочной трубке, которая все еще содержит оставшиеся 20 мкл PBS. Если слизь избыточна и кончик засоряется, используйте чистый наконечник p-200, чтобы собрать оставшийся материал и поместить его в ту же промывочную трубку. Вагинально вводят 20 мкл концентрированной бактериальной суспензии или контроля транспортного средства во влагалище каждой мыши. Инокулируйте каждую мышь сразу после вагинального лаважа для этой мыши (т. Е. Выполняйте промывание и инокуляцию последовательно для каждой мыши, прежде чем перейти к следующей). Чтобы упростить этот процесс, используйте две пипетки p200 – одна установлена на 50 мкл для промывания, а другая на 20 мкл для прививок.Удерживайте мышь, как описано в шаге 3.2.1. Используя наконечник p-200, пипетку 20 мкл бактериальной суспензии во влагалище. Для экспериментов по совместной вакцинации с использованием двух различных видов / штаммов бактерий используйте 10 мкл каждой бактериальной суспензии и избегайте смешивания двух штаммов перед посевом.ПРИМЕЧАНИЕ: Общий объем прививок не должен превышать 20 мкл, чтобы избежать перетекания из влагалища. Продолжайте удерживать задний конец каждой мыши в течение 10-20 с, чтобы предотвратить немедленное накопление введенного объема во влагалищном интроитусе. Затем поместите мышь в новую клетку / сосуд или с партнерами по клетке, которые уже были привиты. Повторите шаг 3.2. и шаг 3.3. для каждой мыши. Никогда не помещайте мышей обратно в клетку с животными, которые еще не были привиты. Это предотвращает непреднамеренное воздействие на мышей устойчивых к стрептомицину бактерий перед прививкой. После того, как все мыши были привиты, циклическую трубку инокулята обратно в анаэробную камеру. Подготовьте и нанесите еще одно последовательное разбавление, как описано на этапе 2.5. Это пост-инокуляционный КОЕ. Сравните КОЕ из пластин после инокуляции и до инокуляции, чтобы определить, снизилась ли жизнеспособность инокулята за пределами анаэробной камеры во время посева животных. Пластинчатые влагалищные промывания собраны на этапе 3.2. на селективный агар (в данном случае 1 мг/мл стрептомицина). Инкубируйте пластины в течение 1-2 дней в анаэробной камере при 37 °C и исследуйте на наличие роста.ПРИМЕЧАНИЕ: Рост указывает на то, что эндогенные члены микробиома устойчивы к маркеру отбора и, следовательно, могут скрывать перечисление КОЕ целевого организма. 4. Сбор влагалищных лаважей для определения жизнеспособной колонизации Gardnerella Соберите вагинальные промывки в выбранные моменты времени, чтобы проанализировать колонизацию влагалища. Соберите, как описано в шаге 3.2. Сразу после сбора проведите вагинальные промывания в анаэробную камеру. Используйте 10 мкл каждого промывания для выполнения последовательного разбавления и нанесения покрытия на селективный агар, как описано на этапе 2.5. Используйте количество КОЕ в качестве меры вагинальной колонизации гарднереллой (или другим анаэробом, представляющим интерес). 5. Жертвоприношение, рассечение и гомогенизация тканей Подготовьте трубку 5 мл для каждого органа, собираемого у каждой мыши (например, если собираются влагалище, шейка матки и матка, подготовьте три трубки на мышь). Заполните каждый тюбик стерильным анаэробным 1x PBS (или другими средами гомогенизации) в анаэробной камере. Используйте 1 мл PBS для трубок, используемых для сбора влагалища и шейки матки, и 750 мкл для трубок, используемых для сбора маточных рогов. После добавления PBS взвесьте каждую отдельную трубку (это вес перед сбором и будет использоваться для определения общего веса каждой собранной ткани). Если весы недоступны в анаэробной камере, плотно закройте трубки и выведите их из камеры для взвешивания, а затем верните их обратно.ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка трубок и сбор веса могут быть сделаны за 1 день до жертвоприношения, но трубки должны храниться в анаэробной камере с плотно закрытыми колпачками для предотвращения испарения. Подготовьте набор ванн для промывания влагалища, как описано в шаге 3.1. собрать последний промывание при жертвоприношении. Кроме того, приготовьте стакан деионизированной (DI) воды объемом 50 мл и второй стакан 70-90% этанола объемом 50 мл для использования для промывки и стерилизации стандартных инструментов для рассечения стали во время жертвоприношения. Выведите заполненные PBS трубки для сбора органов из анаэробной камеры. Держите трубки плотно закрытыми, пока ткани не будут готовы к добавлению. Принесите в жертву каждую мышь, используя методы, одобренные IACUC. Выполните окончательное промывание, как описано в шагах 3.2.2. и 3.2.3. либо непосредственно перед жертвоприношением, либо сразу после него. Начинают рассечение и сбор тканей. Распылите вниз по животу и спине каждой мыши 70% этанола. Стерилизуйте ножницы в стакане с этанолом, дайте им высохнуть, а затем сделайте один вертикальный срез мышей абдоминопелвистической полости. Используйте стерильные щипцы, чтобы оттянуть кожу назад и осторожно вытолкнуть кишечник из полости тела и в сторону открытого поля, что обнажит репродуктивный тракт.ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не проколоть или не проколоть кишечник, так как они могут содержать устойчивые к стрептомицину бактерии, которые могут спутать результаты экспериментов. Чтобы собрать максимум влагалищной ткани, переломите лобковую кость во время некропсии. Используя стерильные ножницы, обрежьте центр лобковой кости (лобковый симфиз), стараясь не врезаться во влагалище. Используя два набора стерильных щипцов, захватите каждую сторону таза и потяните таз открытым сбоку, обнажая нижнюю часть влагалища под ним. Используйте щипцы, чтобы мягко захватить шейку матки (более твердая структура по сравнению с окружающими тканями). Осторожно подтяните шейку матки, чтобы обнажить толстую кишку, скрытую позади и тесно связанную с влагалищем. Используйте небольшие ножницы, чтобы освободить влагалище от наружных соединительных тканей. Тщательно отделите влагалище от толстой кишки и избегайте прокалывания кишечного тракта. Когда вы полностью освобождены, обрамляйте влагалище в интроиту ножницами и ножницами, чтобы освободиться от тела мыши. Поддерживайте мягкий захват шейки матки, слегка подтягиваясь, чтобы сделать рога матки более заметными. Другой рукой обрежьте непосредственно под яичниками с правой и левой стороны, чтобы освободить рога матки. Удалите теперь отключенный репродуктивный тракт из полости тела и поместите его в стерильную пластину Петри. С помощью бритвы отделите рога матки, шейку матки и влагалище. Поместите каждую ткань в соответствующую маркированную коллекционную трубку. Если цитокины собираются собирать, поместите трубки на лед после добавления ткани. Взвесьте каждый тюбик еще раз после того, как ткань была добавлена. Это вес после сбора. Вычтите вес до сбора из веса после сбора, чтобы получить общий вес ткани. Используйте портативный гомогенизатор для гомогенизации органов в их коллекционных трубках. Для Gardnerella JCP8151B выполните этот шаг в шкафу биобезопасности (аэробно) или анаэробной камере.Подготовьте несколько комплектов трубок для промывки и асептической обработки ручного гомогенизатора между образцами. Убедитесь, что каждый набор имеет три конические трубки по 50 мл: одна заполнена водой DI, одна с 70% этанолом, а третья с 1x PBS. Подготовьте отдельный набор промывочных трубок для каждой группы лечения мышей. Чтобы очистить гомогенизатор, опустите лезвия в жидкость в каждой промывочной трубке и поверните прибор на максимальную скорость. Держите гомогенизатор в каждой из трех трубок около 3 с. Порядок промывки – вода DI (для удаления физического мусора), затем этанол (для дезинфекции) и, наконец, 1x PBS (для нейтрализации). Встряхните зонд на бумажное полотенце или одноразовую прокладку для скамейки, чтобы удалить лишнюю жидкость между каждым ополаскивателем. После первоначального промывания гомогенизируйте ткани, опустив зонд гомогенизатора на дно коллекционной трубки, захватывая ткань под ней. Включите гомогенизатор, чтобы измельчить ткань, осторожно перемещая зонд вверх и вниз примерно в 5 раз, оставаясь под водой. Гомогенизируйте каждый орган в течение примерно 15-30 с. После выключения и извлечения гомогенизатора из пробирки визуально осмотрите содержимое, чтобы убедиться в полном разрушении тканей. Это особенно важно для шейки матки и влагалища, которые иногда не могут быть пойманы зондом.ПРИМЕЧАНИЕ: Это нормально, если избыток жира на рогах матки не полностью гомогенизируется. Повторите шаги 5.14.1.-5.14.4., промывая и стерилизуя зонд между каждым образцом. Переключитесь на новый набор промывочных трубок для каждой экспериментальной группы. Переместите трубки с гомогенизированными образцами в анаэробную камеру. Чтобы определить бактериальную нагрузку каждой ткани, выполняют кратковременное мягкое вихрь образца для смешивания, затем удаляют 100 мкл тканевого гомогената для последовательного разведения и нанесения покрытия на селективный агар для определения КОЕ (первое разведение составляет 1 х 100). Если требуется нижний предел обнаружения, выполните разбрасывание 200-250 мкл неразбавленного гомогената.