Ce protocole détaille une méthode pour la dissection des dépôts adipeux de souris et l’isolement et la digestion des artères respectives pour libérer puis identifier la population de cellules endothéliales. Les cellules fraîchement isolées utilisées dans des applications en aval feront progresser la compréhension de la biologie cellulaire vasculaire et des mécanismes du dysfonctionnement vasculaire.
Les cellules endothéliales vasculaires qui tapissent la paroi du système vasculaire jouent un rôle important dans divers processus physiologiques, notamment la régulation du tonus vasculaire, les fonctions de barrière et l’angiogenèse. Le dysfonctionnement des cellules endothéliales est un prédicteur caractéristique et un facteur majeur de la progression des maladies cardiovasculaires graves, mais les mécanismes sous-jacents restent mal compris. La possibilité d’isoler et d’effectuer des analyses sur des cellules endothéliales de divers lits vasculaires dans leur forme native donnera un aperçu des processus des maladies cardiovasculaires. Ce protocole présente la procédure de dissection des tissus adipeux sous-cutanés et mésentériques de souris, suivie de l’isolement de leur système vasculaire artériel respectif. Les artères isolées sont ensuite digérées à l’aide d’un cocktail spécifique d’enzymes digestives axées sur la libération de cellules endothéliales fonctionnellement viables. Le tissu digéré est évalué par cytométrie en flux à l’aide de cellules CD31+/CD45− comme marqueurs pour l’identification positive des cellules endothéliales. Les cellules peuvent être triées pour des tests fonctionnels immédiats en aval ou utilisées pour générer des lignées cellulaires primaires. La technique d’isolement et de digestion des artères de différents lits vasculaires offrira aux chercheurs des options pour évaluer les cellules vasculaires fraîchement isolées des artères d’intérêt et leur permettra d’effectuer un large éventail de tests fonctionnels sur des types de cellules spécifiques.
Les cellules endothéliales sont bien reconnues pour leurs rôles importants dans une variété de processus physiologiques, y compris les fonctions de barrière, l’angiogenèse et la régulation du tonus vasculaire 1,2. Bien que le dysfonctionnement des cellules endothéliales soit bien documenté dans la promotion de l’athérosclérose, de l’hypertension, du diabète, etc., les mécanismes sous-jacents à l’origine du dysfonctionnement endothélial restent mal compris et diffèrent probablement entre des lits vasculaires distincts 2,3,4. L’effort pour démêler ces mécanismes pathologiques du dysfonctionnement des cellules endothéliales est remis en question par l’accès limité à une population pure de cellules endothéliales à partir de tissus et/ou les changements phénotypiques des cellules endothéliales en culture 5,6. Par conséquent, être capable d’isoler et d’effectuer des analyses sur des cellules endothéliales de divers lits vasculaires dans leur forme native donnera un aperçu des processus de la maladie cardiovasculaire.
Ce protocole présente la procédure de dissection des tissus adipeux sous-cutanés et mésentériques de souris, suivie de l’isolement de leur système vasculaire artériel respectif. Les cellules endothéliales fonctionnellement viables qui tapissent les parois artérielles sont libérées à l’aide d’un cocktail spécifique d’enzymes. Un soin particulier a été apporté à l’optimisation des conditions du protocole de digestion afin d’obtenir un rendement suffisant en cellules endothéliales à partir de <1 mg de tissu de départ tout en conservant les marqueurs biomoléculaires intacts pour l’analyse. Les cellules endothéliales isolées sont ensuite identifiées par cytométrie de flux. La présence de CD31 (PECAM) est principalement utilisée pour identifier les cellules endothéliales. En raison de l’expression de CD31 dans d’autres types cellulaires, y compris plusieurs d’origine hématopoïétique qui expriment également CD45, la pureté des cellules endothéliales isolées a été encore améliorée par l’exclusion des cellules exprimant à la fois CD31 et CD45 5,6,7,8. De plus, selon la question de recherche et les applications en aval à utiliser, les chercheurs devraient envisager de sélectionner un vaste panel de marqueurs de sélection positifs et négatifs afin d’optimiser la pureté de la population cellulaire d’intérêt.
Bien que la technique de dissection et d’isolement des artères dépôts adipeuses ait été utilisée dans les publications précédentes 9,10,11,12,13, un protocole détaillé décrivant l’isolement des artères encastrées n’a pas encore été présenté. La démonstration de la technique d’isolement et de digestion des artères de différents lits vasculaires d’une espèce d’intérêt donnée offrira aux chercheurs des options pour évaluer des cellules vasculaires fraîchement isolées provenant d’artères d’intérêt et leur permettra d’effectuer un large éventail de tests fonctionnels sur des types de cellules spécifiques. Les tests peuvent inclure, sans toutefois s’y limiter, la cytométrie en flux pour le tri cellulaire et l’expression des protéines membranaires5,8, l’électrophysiologie pour l’activité des canaux ioniques9, le profilage moléculaire (analyses protéomiques/génomiques, etc.) 14,15, et la génération de lignées cellulaires primaires pour le criblage de médicaments in vitro16,17.
Le dysfonctionnement endothélial est un précurseur d’états pathologiques graves, probablement à l’origine du développement de l’athérosclérose, de l’hypertension et des accidents vasculaires cérébraux 3,23. Bien que les mécanismes identifiés sous-jacents au dysfonctionnement endothélial dans un état pathologique donné soient nombreux, des lits vasculaires distincts sont susceptibles d’être influencés différemment par des conditions pathologiques 4,24. De plus, différents facteurs de risque cardiovasculaires (p. ex. obésité, hypertension, dyslipidémie, tabagisme, diabète) induisent un dysfonctionnement par divers mécanismes distincts23,25. Par conséquent, il est essentiel d’isoler les populations de cellules endothéliales à partir de modèles animaux établis de maladie ou de tissus humains accessibles et d’effectuer des tests sur des cellules immédiatement retirées de l’environnement in vivo. L’isolement des cellules de cette manière présente un avantage unique par rapport à l’étude des cellules en culture en ce sens qu’elles sont exemptes de changements phénotypiques induits par la culture 5,6. De plus, l’inclusion d’une population de cellules endothéliales hétérogènes, telle qu’observée in vivo 26,27 (et qui peut être séparée davantage par tri cellulaire assisté par flux), d’un organisme vivant informe mieux l’environnement in vivo. Enfin, cette méthode est applicable à l’étude de nombreux modèles animaux et potentiellement de tissus humains et peut être utilisée pour générer des lignées de culture cellulaire primaire, si un tel besoin est justifié.
L’étape critique de ce protocole, et l’étape qui nécessitera le plus d’ajustements pour différents lits vasculaires ou types de cellules non présentés ici, est la digestion du tissu vasculaire. Cette étape doit être optimisée pour la santé cellulaire sans diminuer le rendement cellulaire. Les enzymes spécifiques utilisées et la durée de la digestion sont essentielles pour optimiser la santé cellulaire et le rendement afin de pouvoir effectuer correctement les tests en aval. Pour l’identification de l’expression membranaire de CD36, telle que détectée par cytométrie en flux dans les cellules endothéliales sous-cutanées et mésentériques (Figure 4), une version modifiée du protocole de digestion conçu à l’origine pour l’électrophysiologie patch-clamp28 a été développée. Cela comprenait une extension du temps de digestion de la collagénase I à 30 minutes pour augmenter les rendements cellulaires afin de mieux répondre aux exigences de la cytométrie en flux par rapport à ce qui est requis pour les études patch-clamp. Comme cette modification peut avoir un impact sur la santé cellulaire dans une certaine mesure, une coloration de viabilité cellulaire a été utilisée dans les analyses de cytométrie en flux pour s’assurer que seules les cellules endothéliales viables étaient évaluées selon ce protocole (Figure 3). Il est recommandé que les études visant à isoler les cellules du tissu vasculaire incluent un marqueur de viabilité cellulaire avant d’évaluer l’approche souhaitée.
Le protocole décrit est suffisant pour libérer des cellules endothéliales viables pour analyse et applications en aval à partir d’échantillons artériels de ≤1 mg provenant de souris; Cependant, si les artères d’intérêt devaient être isolées de différents tissus ou organismes (p. ex. humains) qui entraîneraient des masses artérielles significativement différentes, il faudrait optimiser la teneur en enzymes de digestion et la durée d’incubation pour isoler efficacement la population cellulaire d’intérêt. Pour certains lits vasculaires qui commencent avec des quantités encore plus petites de tissu de départ que les lits sous-cutanés et mésentériques présentés ici (p. ex. artères coronaires), la mise en commun des artères de plusieurs souris peut être nécessaire par échantillon. En effet, cela peut être une étape nécessaire pour un lit vasculaire donné étant donné que l’approche des résultats nécessite un rendement cellulaire relativement élevé. Une limitation majeure est que, en raison de la nature des variations par digestion de l’échantillon, les rendements cellulaires peuvent parfois être significativement différents d’un lot à l’autre, même lorsqu’ils proviennent du même lit vasculaire. Cela peut entraîner des problèmes lors de l’analyse des données et doit être pris en compte via la normalisation le cas échéant. Par exemple, l’expression de CD36 était extrêmement variable dans les données brutes en raison des modifications des rendements cellulaires dans des échantillons individuels d’artères adipeuses sous-cutanées et mésentériques. Par conséquent, les données brutes ont été normalisées à l’intensité moyenne de fluorescence CD31+CD45− en supposant que cette méthode corrigerait les différences entre les lots (figure 4). Bien entendu, selon l’approche, des analyses statistiques et des méthodes de normalisation plus sophistiquées peuvent être nécessaires.
En résumé, cet article présente une méthode pour disséquer, isoler et digérer les artères sous-cutanées et mésentériques de souris afin d’étudier l’expression et / ou la fonction de cibles endothéliales d’intérêt. Avec des modifications au protocole présenté, différents lits vasculaires et types de cellules (par exemple, les cellules musculaires lisses) peuvent être étudiés. Ce protocole, en tant que fondement d’une pléthore d’approches expérimentales disponibles, a le potentiel de faire progresser la compréhension de la biologie cellulaire vasculaire et des mécanismes du dysfonctionnement vasculaire.
The authors have nothing to disclose.
À la mémoire affectueuse de Rich West, un brillant scientifique, collègue et ami cher. Nous tenons à remercier le noyau de cytométrie en flux et de bioimagerie de l’Université du Delaware dans le cadre du Delaware Biotechnology Institute pour leurs contributions continues à nos études. Nous tenons également à remercier Emma Hudgins pour l’examen et la révision minutieux du manuscrit. Notre travail est soutenu par l’Institut national des sciences médicales générales P20GM113125-6564 (I.S. Fancher). Ce projet a également été soutenu par le programme Delaware INBRE, avec une subvention du NIGMS (P20GM103446) des National Institutes of Health et de l’État du Delaware (I.S. Fancher), et une subvention de recherche de l’Université du Delaware General University (I.S. Fancher). Ce contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les opinions officielles des NIH.
Tissue dissection tools | |||
5 forceps (2) | Fine Science Tools | 11252-00 | For isolation of mesenteric adipose depot and arteries transfer |
55 forceps (2) | Fine Science Tools | 11295-51 | For parenchymal adipose removal |
Curved Bonn scissors | Fine Science Tools | 14061-10 | For isolation of mesenteric adipose depot |
Graefe forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | For general dissection steps and isolation of subcutaneous adipose depot |
Straight Bonn scissor | Fine Science Tools | 14060-09 | For general dissection steps and isolation of subcutaneous adipose depot |
Stereoscope with light source | Laxco | Z230PT40 | For parenchymal adipose removal and artery isolation |
Digestive enzymes for Artery Digestion | |||
Collagenase Type I | Wothington-BioChem | LS004194 | |
Dispase (Neutral Protease) | Wothington-BioChem | LS02110 | |
Elastase | Wothington-BioChem | LS002292 | |
Solutions Recipes | |||
HEPES Buffer, pH 7.4 | Final concentration | ||
Calcium chloride dihydrate | J.T.Baker | 1332-1 | 2 mM |
Dextrose (D-glucose) anhydrous | Fisher | D16-500 | 10 mM |
HEPES | Fisher | BP310-500 | 10 mM |
Magnesium Chloride | Fisher | M33-500 | 1 mM |
Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | 5 mM |
Sodium chloride | Oxoid | LP0005 | 145 mM |
Dissociation Solution, pH 7.30-7.40 | |||
Dextrose (D-glucose) anhydrous | Fisher | D16-500 | 10 mM |
HEPES | Fisher | BP310-500 | 10 mM |
Magnesium Chloride | Fisher | M33-500 | 2 mM |
Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | 56 mM |
Sodium chloride | Oxoid | LP0005 | 55 mM |
Sodium L-Glutamate monohydrate | TCI | G0188 | 80 mM |
Flow Cytometry Analyses | |||
5 mL Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap | Falcon | 352235 | |
CD31-PE | Miltenyi Biotec | 130-119-653 | 0.75µg/sample |
CD36-APC | R&D Systems | AF2519 | 2.5µg/ sample |
CD45-FITC | BioLegend | 103108 | 2.5µg/ sample |
Live/Dead Fixable Violet Dead Cell Staining kit (cell viability stain) | Invitrogen | L34955 | 1µL/sample |