Kvantitativ 3D-avbildning av trypanosoma cruzi-infiserte celler, sovende amastigoter og T-celler i intakte avklarte organer
Summary
Denne protokollen beskriver lysstofffluorescerende mikroskopi og automatiserte programvareassisterte metoder for å visualisere og nøyaktig kvantifisere prolifererende og sovende Trypanosoma cruzi-parasitter og T-celler i intakte, klarerte organer og vev. Disse teknikkene gir en pålitelig måte å evaluere behandlingsresultater og gir ny innsikt i parasitt-vert-interaksjoner.
Abstract
Chagas sykdom er en forsømt patologi som påvirker millioner av mennesker over hele verden, hovedsakelig i Latin-Amerika. Chagas sykdomsmiddel, Trypanosoma cruzi (T. cruzi), er en obligatorisk intracellulær parasitt med en mangfoldig biologi som infiserer flere pattedyrarter, inkludert mennesker, som forårsaker hjerte- og fordøyelsespatologier. Pålitelig påvisning av T. cruzi in vivo-infeksjoner har lenge vært nødvendig for å forstå Chagas sykdoms komplekse biologi og nøyaktig evaluere utfallet av behandlingsregimer. Den nåværende protokollen demonstrerer en integrert rørledning for automatisert kvantifisering av T. cruzi-infiserte celler i 3D-rekonstruerte, ryddede organer. Light-sheet fluorescerende mikroskopi muliggjør nøyaktig visualisering og kvantifisering av aktivt prolifererende og sovende T. cruzi parasitter og immuneffektorceller i hele organer eller vev. Også CUBIC-HistoVision-rørledningen for å oppnå ensartet merking av klarerte organer med antistoffer og kjernefysiske flekker ble vellykket vedtatt. Vevsrydding kombinert med 3D-immunstaining gir en objektiv tilnærming til omfattende evaluering av legemiddelbehandlingsprotokoller, forbedrer forståelsen av den cellulære organisasjonen av T. cruzi-infisert vev, og forventes å fremme funn relatert til anti-T. cruzi immunresponser, vevskader og reparasjon i Chagas sykdom.
Introduction
Chagas sykdom, forårsaket av protozoparasitten T. cruzi, er blant verdens mest forsømte tropiske sykdommer, og forårsaker omtrent 13.000 årlige dødsfall. Infeksjonen utvikler seg ofte fra et akutt til et kronisk stadium som produserer hjertepatologi hos 30% av pasientene, inkludert arytmier, hjertesvikt og plutselig død 1,2. Til tross for den sterke vertsimmunresponsen som fremkalles mot parasitten i den akutte fasen, fortsetter lavt antall parasitter kronisk gjennom vertsens liv i vev som hjerte og skjelettmuskulatur. Flere faktorer, inkludert forsinket utbrudd av adaptive immunresponser og tilstedeværelsen av ikke-replikerende former for parasitten, kan bidra til kapasiteten til T. cruzi for å unngå fullstendig eliminering av immunsystemet 3,4,5,6. Videre viser ikke-replikerende sovende former av parasitten lav følsomhet for trypanocidale legemidler og kan delvis være ansvarlig for behandlingssvikt observert i mange tilfeller 7,8.
Utviklingen av nye avbildningsteknikker gir en mulighet til å få innsikt i den romlige fordelingen av parasittene i det infiserte vevet og deres forhold til immuncellene som er involvert i deres kontroll. Disse egenskapene er avgjørende for en bedre forståelse av prosessene for parasittkontroll av immunsystemet og sporing av de sjeldne sovende parasittene som er tilstede i kronisk vev.
Light-sheet fluorescensmikroskopi (LSFM) er en av de mest omfattende og objektive metodene for 3D-avbildning av store vev eller organer uten tynnsnitt. Lysarkmikroskoper bruker et tynt ark med lys for bare å opphisse fluoroforene i fokalplanet, redusere fotobleking og fototoksisitet av prøver, og ta bilder av tusenvis av vevslag ved hjelp av ultra-raske kameraer. Det høye nivået av vevsgjennomsiktighet som er nødvendig for riktig penetrasjon av laserlyset i vev, oppnås ved å homogenisere brytningsindeksen (RI) etter vevsdelipidering og avfarging, noe som reduserer spredning av lys og gjengir bilder av høy kvalitet 9,10,11.
Vevsryddingsmetoder er utviklet for avbildning av hele mus 12,13,14, organoider 15,16,17, organer som uttrykker reporter fluorescerende markører 18,19,20,21,22,23, og nylig et begrenset antall humane vev 24 . De nåværende metodene for vevsrydding er klassifisert i tre familier: (1) organiske løsningsmiddelbaserte metoder som DISCO-protokoller 25,26, (2) hydrogelbaserte metoder, som CLARITY27, og vandige metoder, for eksempel CUBIC (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis)18,19,28,29 . KUBIC-protokoller opprettholder organform og vevsintegritet, og bevarer fluorescensen av endogent uttrykte reporterproteiner. Den siste oppdateringen av denne teknikken, CUBIC-HistoVision (CUBIC-HV), tillater også påvisning av epitoper ved bruk av fluorescerende merkede antistoffer og DNA-merking28.
I denne protokollen ble CUBIC-rørledningen for å oppdage T. cruzi som uttrykker fluorescerende proteiner i avklart intakt musevev brukt. Optisk gjennomsiktig vev ble LSFM-avbildet, 3D-rekonstruert, og det nøyaktige totale antallet T. cruzi-infiserte celler, sovende amastigoter og T-celler per organ ble automatisk kvantifisert. Også denne protokollen ble vellykket vedtatt for å oppnå ensartet merking av klarerte organer med antistoffer og kjernefysiske flekker. Disse tilnærmingene er avgjørende for å forstå utvidelse og kontroll av T. cruzi i infiserte verter og er nyttige for full evaluering av kjemo- og immunterapi for Chagas sykdom.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fraværet av omfattende, helorganavbildning av parasitter og immunresponsen begrenser forståelsen av kompleksiteten i vertsparasittinteraksjonene og hindrer evalueringen av terapier for Chagas sykdom. Den nåværende studien vedtok COCUIC-rørledningen for å klargjøre og flekke intakte organer og vev av T. cruzi-infiserte mus.
Flere vevsklareringsprotokoller ble testet i denne studien (PACT32, ECi 33, FLASH34, iDISCO 11,26<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Etsuo Susaki for deres verdifulle hjelp og anbefalinger angående vevsrydding og immunostaining protokoller. Vi er også takknemlige for M. Kandasamy fra CTEGD Biomedical Microscopy Core for teknisk støtte ved bruk av LSFM og konfokal bildebehandling. Vi takker også alle medlemmene i Tarleton Research Group for nyttige forslag gjennom hele denne studien.
Materials
| 1-methylimidazole | Millipore Sigma | 616-47-7 | |
| 2,3-Dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone (Antipyrine | TCI | D1876 | |
| 6-wells cell culture plates | ThermoFisher Scientific | 140675 | |
| AlexaFluor 647 anti-mouse Fab fragment | Jackson Immuno Research Laboratories | 315-607-003 | |
| AlexaFluor 647 anti-rabbit Fab fragment | Jackson Immuno Research Laboratories | 111-607-003 | |
| anti-GFP nanobody Alexa Fluor 647 | Chromotek | gb2AF647-50 | |
| anti-RFP | Rockland | 600-401-379 | |
| anti-α-SMA | Sigma | A5228 | |
| B6.C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #007914 | Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D |
| B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #007914 | Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D |
| BOBO-1 Iodide | ThermoFisher Scientific | B3582 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | #A7906 | |
| C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #032080 | Common Name: Cd8a-Cre (E8III-Cre) |
| CAPSO | Sigma | #C2278 | |
| Cleaning wipes Kimwipes | Kimberly-Clark | T8788 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Zeiss | LSM 790 | |
| CUBIC-HV 1 3D immunostaining kit | TCI | C3699 | |
| CUBIC-HV 1 3D nuclear staining kit | TCI | C3698 | |
| CUBIC-L | TCI | T3740 | |
| CUBIC-P | TCI | T3782 | |
| CUBIC-R+ | TCI | T3741 | |
| Cyanoacrylate-based gel superglue | Scotch | 571605 | |
| DiR (DiIC18(7); 1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindotricarbocyanine iodide) Company: Biotium | Biotium | #60017 | |
| Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | 60-00-4 | |
| Falcon Centrifuge tubes 15 mL | Corning | CLS430791 | |
| Falcon Centrifuge tubes 50 mL | Corning | CLS430290 | |
| Formalin | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Heparin | ThermoFisher Scientific | J16920.BBR | |
| Hyaluronidase | Sigma | #H3884 or #H4272 | |
| Imaris File Converter x64 | BitPlane | v9.2.0 | |
| Imaris software | BitPlane | v9.3 | |
| ImSpector software | LaVision BioTec, Miltenyi Biotec | v6.7 | |
| Intravenous injection needle 23-G | Sartori, Minisart Syringe filter | 16534 | |
| Kimwipes | lint free wipes | ||
| Light-sheet fluorescent microscope | Miltenyi Biotec | ULtramicroscope II imaging system | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | 041838.K2 | |
| Micropipette tips, 10 µL, 200 µL and 1,000 µL | Axygen | T-300, T-200-Y and T-1000-B | |
| Motorized pipet dispenser | Fisher Scientific, Fisherbrand | 03-692-172 | |
| Mounting Solution | TCI | M3294 | |
| N-butyldiethanolamine | TCI | B0725 | |
| Nicotinamide | TCI | N0078 | |
| N-Methylnicotinamide | TCI | M0374 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| RedDot 2 Far-Red Nuclear Stain | Biotium | #40061 | |
| Sacrifice Perfusion System | Leica | 10030-380 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Serological pipettes | Costar Sterile | 4488 | |
| Shaking incubator | TAITEC | BR-43FM MR | |
| Sodium azide (NaN3) | ThermoFisher Scientific | 447815000 | |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | ThermoFisher Scientific | L13098.36 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | ThermoFisher Scientific | 447302500 | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | ThermoFisher Scientific | 014707.A9 | |
| SYTOX-G Green Nucleic Acid Stain | ThermoFisher Scientific | S7020 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
References
- Schofield, C. J., Jannin, J., Salvatella, R. The future of Chagas disease control. Trends in Parasitology. 22 (12), 583-588 (2006).
- Marin-Neto, J. A., Cunha-Neto, E., Maciel, B. C., Simoes, M. V. Pathogenesis of chronic Chagas heart disease. Circulation. 115 (9), 1109-1123 (2007).
- Tarleton, R. L. CD8+ T cells in Trypanosoma cruzi infection. Seminars in Immunopathology. 37 (3), 233-238 (2015).
- Padilla, A. M., Simpson, L. J., Tarleton, R. L. Insufficient TLR activation contributes to the slow development of CD8+ T cell responses in Trypanosoma cruzi infection. Journal of Immunology. 183 (2), 1245-1252 (2009).
- Basso, B. Modulation of immune response in experimental Chagas disease. World Journal of Experimental Medicine. 3 (1), 1-10 (2013).
- Martin, D. L., et al. CD8+ T-Cell responses to Trypanosoma cruzi are highly focused on strain-variant trans-sialidase epitopes. PLOS Pathogens. 2 (8), 77 (2006).
- Sanchez-Valdez, F. J., Padilla, A., Wang, W., Orr, D., Tarleton, R. L. Spontaneous dormancy protects Trypanosoma cruzi during extended drug exposure. Elife. 7, 34039 (2018).
- Sanchez-Valdez, F., Padilla, A. In situ detection of dormant Trypanosoma cruzi amastigotes using bioluminescent-fluorescent reporters. Methods in Molecular Biology. 1955, 179-186 (2019).
- Vieites-Prado, A., Renier, N. Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology. Development. 148 (18), 199369 (2021).
- Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 21, 61-79 (2020).
- Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. L., Erturk, A. A guidebook for DISCO tissue clearing. Molecular Systems Biology. 17, 9807 (2021).
- Pan, C., et al. Deep learning reveals cancer metastasis and therapeutic antibody targeting in the entire body. Cell. 179 (7), 1661-1676 (2019).
- Qi, Y., et al. FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs. Science Advances. 5, 8355 (2019).
- Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience. 22, 317-327 (2019).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
- Hu, H., et al. Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
- Tainaka, K., et al. Chemical landscape for tissue clearing based on hydrophilic reagents. Cell Reports. 24 (8), 2196-2210 (2018).
- Murakami, T. C., et al. A three-dimensional single-cell-resolution whole-brain atlas using CUBIC-X expansion microscopy and tissue clearing. Nature Neuroscience. 21, 625-637 (2018).
- Zhao, S., et al. Cellular and molecular probing of intact human organs. Cell. 180 (4), 796-812 (2020).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature Methods. 10, 508-513 (2013).
- Susaki, E. A., et al. Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues. Nature Communications. 11, 1982 (2020).
- Kubota, S. I., et al. Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution. Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Bustamante, J. M., et al. A modified drug regimen clears active and dormant trypanosomes in mouse models of Chagas disease. Science Translational Medicine. 12 (567), (2020).
- Wang, H., Khoradmehr, A., Tamadon, A. FACT or PACT: A comparison between free-acrylamide and acrylamide-based passive sodium dodecyl sulfate tissue clearing for whole tissue imaging. Cell Journal. 21 (2), 103-114 (2019).
- Hofmann, J., Gadjalova, I., Mishra, R., Ruland, J., Keppler, S. J. Efficient tissue clearing and multi-organ volumetric imaging enable quantitative visualization of sparse immune cell populations during inflammation. Frontiers in Immunology. 11, 599495 (2020).
- Messal, H. A., et al. Antigen retrieval and clearing for whole-organ immunofluorescence by FLASH. Nature Protocols. 16, 239-262 (2021).
- Kolesova, H., Capek, M., Radochova, B., Janacek, J., Sedmera, D. Comparison of different tissue clearing methods and 3D imaging techniques for visualization of GFP-expressing mouse embryos and embryonic hearts. Histochemistry and Cell Biology. 146 (2), 141-152 (2016).
- Chen, Y., et al. A versatile tiling light sheet microscope for imaging of cleared tissues. Cell Reports. 33, 108349 (2020).
