無傷の清澄化臓器における トリパノソーマクルジ感染細胞、休眠中のアマスティゴート、およびT細胞の定量的3Dイメージング
Summary
本プロトコルは、無傷で除去された臓器および組織における増殖および休眠中の トリパノソーマクルジ 寄生虫およびT細胞を視覚化および正確に定量するためのライトシート蛍光顕微鏡法および自動化されたソフトウェア支援方法について説明しています。これらの手法は、治療結果を評価するための信頼できる方法を提供し、寄生虫と宿主の相互作用に関する新しい洞察を提供します。
Abstract
シャーガス病は、ラテンアメリカを中心に世界中の何百万人もの人々に影響を与える無視された病理です。シャーガス病剤である トリパノソーマ クルジ(T.クルジ)は、ヒトを含むいくつかの哺乳類種に感染し、心臓および消化器系の病状を引き起こす多様な生物学を持つ絶対性細胞内寄生虫です。 T. cruziのin vivo 感染の信頼性の高い検出は、シャーガス病の複雑な生物学を理解し、治療レジメンの結果を正確に評価するために長い間必要とされてきました。現在のプロトコルは、3D再構築されたクリアされた臓器における T.cruzi感染細胞の自動定量のための統合パイプラインを示しています。ライトシート蛍光顕微鏡法は、臓器または組織全体において活発に増殖および休眠している T. cruzi 寄生虫および免疫エフェクター細胞を正確に視覚化および定量することを可能にする。また、抗体および核染色で透明化された臓器の均一な標識を得るためのCUBIC-HistoVisionパイプラインも採用されました。組織クリアリングと3D免疫染色を組み合わせることで、薬物治療プロトコルを包括的に評価し、 T. cruzi感染組織の細胞組織の理解を深めるための公平なアプローチを提供し、シャーガス病における抗T.クルジ 免疫応答、組織損傷、および修復に関連する発見を進めることが期待されます。
Introduction
原虫寄生虫T. cruziによって引き起こされるシャーガス病は、世界で最も無視されている熱帯病の1つであり、年間約13,000人が死亡しています。感染症はしばしば急性期から慢性期に進行し、不整脈、心不全、突然死などの患者の30%に心臓病を引き起こします1,2。急性期に寄生虫に対して強い宿主免疫応答が誘発されるにもかかわらず、少数の寄生虫は、心臓や骨格筋などの組織で宿主の生涯を通じて慢性的に存続します。適応免疫応答の開始遅延および寄生虫の非複製型の存在を含むいくつかの要因は、免疫系による完全な排除を回避するT. cruziの能力に寄与する可能性がある3,4,5,6。さらに、寄生虫の非複製休眠型は、トリパノシド薬に対する低い感受性を示し、多くの場合に観察される治療の失敗に部分的に関与している可能性があります7,8。
新しいイメージング技術の開発は、感染した組織における寄生虫の空間分布と、それらの制御に関与する免疫細胞との関係についての洞察を得る機会を提供します。これらの特性は、免疫系による寄生虫制御のプロセスをよりよく理解し、慢性組織に存在するまれな休眠中の寄生虫を追跡するために重要です。
ライトシート蛍光顕微鏡(LSFM)は、薄切片なしで大きな組織や臓器を3Dイメージングするための最も包括的で偏りのない方法の1つです。ライトシート顕微鏡は、薄い光シートを利用して、焦点面内の蛍光色素のみを励起し、サンプルの光退色と光毒性を低減し、超高速カメラを使用して数千の組織層の画像を記録します。組織へのレーザー光の適切な浸透に必要な高レベルの組織透明性は、組織の脱脂質化および脱色に続く屈折率(RI)を均質化することによって得られ、光の散乱を低減し、高品質の画像をレンダリングする9,10,11。
組織クリアリングアプローチは、マウス全体12、13、14、オルガノイド15、16、17、レポーター蛍光マーカー18、19、20、21、22、23、および最近では限られた数のヒト組織のイメージングのために開発されています24.現在の組織透明化の方法は、(1)DISCOプロトコル25,26などの有機溶媒ベースの方法、(2)CLARITY27などのヒドロゲルベースの方法、およびCUBICなどの水性方法(透明で遮るもののない脳/身体イメージングカクテルおよび計算分析)18,19,28,29の3つのファミリーに分類されます。.CUBICプロトコルは、臓器の形状と組織の完全性を維持し、内因的に発現したレポータータンパク質の蛍光を維持します。この技術の最新のアップデートであるCUBIC-HistoVision(CUBIC-HV)では、蛍光タグ付き抗体とDNA標識を使用したエピトープの検出も可能です28。
本プロトコルでは、清澄化された無傷のマウス組織において蛍光タンパク質を発現 するT. cruzi を検出するためのCUBICパイプラインを使用した。光学的に透明な組織をLSFM画像化し、3D再構成し、 臓器あたりのT. cruzi 感染細胞、休眠中のアマスティゴート、およびT細胞の正確な総数を自動的に定量化しました。また、このプロトコルは、抗体および核染色で透明化された臓器の均一な標識を得るために首尾よく採用された。これらのアプローチは、感染した宿主における T. cruzi の増殖と制御を理解するために不可欠であり、シャーガス病の化学療法および免疫治療薬を完全に評価するのに役立ちます。
Protocol
Representative Results
Discussion
寄生虫と免疫応答の広範な全臓器イメージングの欠如は、宿主と寄生虫の相互作用の複雑さの理解を制限し、シャーガス病の治療法の評価を妨げます。本研究では、 C. cruzi感染マウスの無傷の臓器および組織を清澄化および染色するためにCUBICパイプラインを採用しました。
この研究では、複数の組織クリアリングプロトコルがテストされました(PACT3…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
須崎悦夫博士の組織透明化および免疫染色プロトコルに関する貴重な支援と推奨事項に感謝します。また、LSFMと共焦点イメージングを使用した技術サポートを提供してくれたCTEGD生物医学顕微鏡コアのM.カンダサミーに感謝しています。また、この研究を通して有益な提案をしてくれたタールトン研究グループのすべてのメンバーに感謝します。
Materials
| 1-methylimidazole | Millipore Sigma | 616-47-7 | |
| 2,3-Dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone (Antipyrine | TCI | D1876 | |
| 6-wells cell culture plates | ThermoFisher Scientific | 140675 | |
| AlexaFluor 647 anti-mouse Fab fragment | Jackson Immuno Research Laboratories | 315-607-003 | |
| AlexaFluor 647 anti-rabbit Fab fragment | Jackson Immuno Research Laboratories | 111-607-003 | |
| anti-GFP nanobody Alexa Fluor 647 | Chromotek | gb2AF647-50 | |
| anti-RFP | Rockland | 600-401-379 | |
| anti-α-SMA | Sigma | A5228 | |
| B6.C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #007914 | Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D |
| B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #007914 | Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D |
| BOBO-1 Iodide | ThermoFisher Scientific | B3582 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | #A7906 | |
| C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #032080 | Common Name: Cd8a-Cre (E8III-Cre) |
| CAPSO | Sigma | #C2278 | |
| Cleaning wipes Kimwipes | Kimberly-Clark | T8788 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Zeiss | LSM 790 | |
| CUBIC-HV 1 3D immunostaining kit | TCI | C3699 | |
| CUBIC-HV 1 3D nuclear staining kit | TCI | C3698 | |
| CUBIC-L | TCI | T3740 | |
| CUBIC-P | TCI | T3782 | |
| CUBIC-R+ | TCI | T3741 | |
| Cyanoacrylate-based gel superglue | Scotch | 571605 | |
| DiR (DiIC18(7); 1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindotricarbocyanine iodide) Company: Biotium | Biotium | #60017 | |
| Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | 60-00-4 | |
| Falcon Centrifuge tubes 15 mL | Corning | CLS430791 | |
| Falcon Centrifuge tubes 50 mL | Corning | CLS430290 | |
| Formalin | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Heparin | ThermoFisher Scientific | J16920.BBR | |
| Hyaluronidase | Sigma | #H3884 or #H4272 | |
| Imaris File Converter x64 | BitPlane | v9.2.0 | |
| Imaris software | BitPlane | v9.3 | |
| ImSpector software | LaVision BioTec, Miltenyi Biotec | v6.7 | |
| Intravenous injection needle 23-G | Sartori, Minisart Syringe filter | 16534 | |
| Kimwipes | lint free wipes | ||
| Light-sheet fluorescent microscope | Miltenyi Biotec | ULtramicroscope II imaging system | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | 041838.K2 | |
| Micropipette tips, 10 µL, 200 µL and 1,000 µL | Axygen | T-300, T-200-Y and T-1000-B | |
| Motorized pipet dispenser | Fisher Scientific, Fisherbrand | 03-692-172 | |
| Mounting Solution | TCI | M3294 | |
| N-butyldiethanolamine | TCI | B0725 | |
| Nicotinamide | TCI | N0078 | |
| N-Methylnicotinamide | TCI | M0374 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| RedDot 2 Far-Red Nuclear Stain | Biotium | #40061 | |
| Sacrifice Perfusion System | Leica | 10030-380 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Serological pipettes | Costar Sterile | 4488 | |
| Shaking incubator | TAITEC | BR-43FM MR | |
| Sodium azide (NaN3) | ThermoFisher Scientific | 447815000 | |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | ThermoFisher Scientific | L13098.36 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | ThermoFisher Scientific | 447302500 | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | ThermoFisher Scientific | 014707.A9 | |
| SYTOX-G Green Nucleic Acid Stain | ThermoFisher Scientific | S7020 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
References
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