Computer Numerical Control Micromilling of a Microfluidic Acrylic Device with a Staggered Restriction for Magnetic Nanoparticle-based Immunoassays

In den letzten Jahren hat die Mikrofluidik eine wichtige Rolle bei Immunoassay-Techniken^{gespielt 1}. Die Miniaturisierungstechnologie hat viele herausragende Vorteile im Vergleich zu herkömmlichen Immunoassays, wie z. B. einen reduzierten Proben- und Reagenzienverbrauch, kürzere Inkubationszeiten, effizienten Lösungsaustausch sowie eine höhere Integration und Automatisierung².

Darüber hinaus reduzieren mikrofluidische Systeme in Immunoassays in Verbindung mit magnetischen Nanopartikeln als Immununterstützung die Inkubationszeiten erheblich und erreichen aufgrund des erhöhten Oberflächen-Volumen-Verhältnisses eine hohe Detektionsempfindlichkeit³. Die Brownsche Bewegung der Partikel verbessert die Reaktionskinetik während der Bildung des Antigen-Antikörper-Komplexes ^4,5. Darüber hinaus bieten die magnetischen Eigenschaften von Nanopartikeln die Vielseitigkeit, in verschiedene mikrofluidische Gerätekonfigurationen integriert zu werden, was sie zu einem idealen Kandidaten für die Signalübertragung und Molekülerfassung in miniaturisierten On-Chip-Biosensorsystemen macht⁵. Allerdings sind die magnetischen Kräfte aufgrund des hohen Oberflächen-Volumen-Verhältnisses deutlich schwächer als die Widerstandskräfte auf der Nanometerskala⁶. Daher kann die Erfassung von Nanopartikeln für entscheidende Immunoassay-Schritte wie Waschen und Detektion eine Herausforderung darstellen, und ein herkömmlicher Magnet reicht nicht aus⁴.

Eine effiziente Möglichkeit, die Nanopartikel zu manipulieren, ist die Verwendung einer mikrofluidischen Magnetfalle, die aus Eisenmikropartikeln besteht, die in einer mikrofluidischen Struktur^{verpackt sind 3}. Wenn sich also ein externer Magnet nähert, entsteht innerhalb des magnetisierten porösen Mediums eine komplexe Wechselwirkung zwischen den magnetischen und den Flusskräften. Die magnetische Kraft, die auf die Nanopartikel wirkt, ist stark genug, um sie einzufangen und dem Strömungswiderstand ^3,4,7 zu widerstehen. Dieser Ansatz erfordert Mikrofabrikationstechniken, die Auflösungen in der Größenordnung von wenigen Mikrometern erreichen, um mikrometrische Strukturen zu erzeugen, die die Mikropartikel zurückhalten.

Aktuelle Mikrofabrikationstechniken ermöglichen die hochauflösende Herstellung von Strukturen von wenigen Mikrometern bis zu Hunderten von^{Nanometern 8}. Viele dieser Techniken erfordern jedoch eine spezielle, teure oder komplizierte Ausrüstung. Eine der Hauptschwierigkeiten ist die Forderung nach einem Reinraum für den Formenbau, der nach wie vor kostspielig und zeitaufwendig^{ist 8,9}. In jüngster Zeit haben Mikrofluidik-Ingenieure diesen Nachteil überwunden, indem sie eine Vielzahl alternativer Fertigungsmethoden mit verschiedenen Vorteilen wie reduzierten Kosten, schnelleren Durchlaufzeiten, billigeren Materialien und Werkzeugen und erhöhter Funktionalität entwickelt^{haben 8}. Auf diese Weise brachte die Entwicklung neuer Mikrofabrikationstechniken kostengünstige Nicht-Reinraum-Methoden, die Auflösungen von nur 10 μm⁸ erreichen. Die Strukturierung kann direkt auf einem Substrat verwendet werden, ohne ein teures Formmuster zu erzeugen, wodurch ein zeitaufwändiger Prozess vermieden wird. Zu den direkten Fertigungsmethoden gehören CNC-Fräsen, Laserablation und Direktlithographie⁸. Alle diese Verfahren eignen sich zur Herstellung von Kanälen mit hohem Aspektverhältnis in einer Vielzahl von Materialien, unabhängig von ihrer Härte⁹, was neue und vorteilhafte Geometrien, physikalisches Verhalten und Qualitäten in mikrofluidischen Bauelementen ermöglicht⁸.

CNC-Mikrofräsen erzeugt mikroskalige Strukturen mit Schneidwerkzeugen, die Schüttgut von einem Substrat entfernen und ist eine effektive Herstellungsmethode für mikrofluidische Geräte^10,11. Die Mikrofrästechnik kann in mikrofluidischen Anwendungen nützlich sein, um Mikrokanäle und Merkmale direkt auf der Arbeitsfläche zu erzeugen, was einen entscheidenden Vorteil bietet: Ein Werkstück kann in kurzer Zeit (weniger als 30 Minuten) hergestellt werden, wodurch die Durchlaufzeit vom Entwurf bis zum Prototyp erheblich verkürzt^{wird 12}. Darüber hinaus macht die breite Verfügbarkeit von Schneidzubehör verschiedener Materialien, Größen und Formen CNC-Fräsmaschinen zu einem geeigneten Werkzeug, das die Herstellung verschiedener Merkmale in vielen Arten von kostengünstigen Einwegmaterialien ermöglicht hat¹³.

Unter allen Materialien, die üblicherweise beim Mikrofräsen verwendet werden, bleiben Thermoplaste aufgrund ihrer vielen günstigen Eigenschaften und ihrer Kompatibilität mit biologischen Anwendungen eine führende Wahl^10,14. Thermoplaste sind aufgrund ihrer signifikanten Vorteile für die Entwicklung kostengünstiger Einweg-Analysesysteme ein attraktives Substrat für mikrofluidische Systeme⁹. Darüber hinaus sind diese Materialien sehr gut für hochvolumige Herstellungsprozesse geeignet, wodurch sie für die Kommerzialisierung und Massenproduktion geeignet sind. Aus diesen Gründen gelten Thermoplaste wie PMMA seit den frühen Jahren der Mikrofluidik als zuverlässige und robuste Materialien¹⁰. Es wurden verschiedene Protokolle beschrieben, um geschlossene Kanäle in Thermoplasten herzustellen, wie z. B. Lösungsmittelbindung¹⁵, Wärmebindung 16 und ultraviolette (UV) / Ozon-Oberflächenbehandlungsbindung¹⁷.

In vielen Fällen reicht die mit herkömmlichen Mikrofräsmaschinen erreichte Positionierauflösung für einige mikrofluidische Anwendungen, die Strukturen kleiner als 10 μm erfordern, nicht aus. High-End-Mikrofräsen hat genug Auflösung. Leider ist seine Verwendung aufgrund der hohen Preise auf eine Handvoll Benutzer beschränkt¹². Zuvor berichtete unsere Forschungsgruppe über die Herstellung und Manipulation eines kostengünstigen Werkzeugs, das die Bearbeitung von Strukturen von weniger als 10 μm ermöglicht und die Auflösung herkömmlicher Fräsmaschinen überwindet¹². Die Leuchte ist eine Plattform, die im 3D-Druck mit einfacher Elektronik hergestellt wird und drei piezoelektrische Aktuatoren enthält. Die Oberfläche enthält scharnierförmige Gelenke, die es ermöglichen, sie anzuheben, wenn die piezoelektrischen Elemente gleichzeitig wirken. Die Verschiebung der Z-Achse kann mit einer Auflösung von 500 nm und einer Genauigkeit von ±1,5 μm¹² gesteuert werden.

Dieses Papier stellt die Schritte des Herstellungsprozesses eines Acrylgeräts (PMMA) durch eine Mikrofrästechnik vor. Das Chipdesign besteht aus einem 200 μm breiten und 200 μm hohen Hauptkanal und einem Seitenkanal mit den gleichen Abmessungen, um den Fluss der Reagenzien zu reinigen. Im zentralen Bereich wird der Kanal durch eine physikalische Beschränkung von nur 5 μm Höhe unterbrochen, die mit der 3D-gedruckten piezoelektrischen Plattform dieser Gruppe¹² hergestellt wurde, um magnetische Mikropartikel einzufangen, die eine magnetische Falle für Nanopartikel bilden, indem ein externer Magnet platziert wird. Wir zeigen die Funktionsweise des mikrofluidischen Geräts durch die Durchführung eines Immunoassays zum Nachweis eines kommerziellen Antikörpers unter Verwendung von Lysozym als Modellantigen, das an 100 nm magnetische Nanopartikel konjugiert ist. Dieses Gerät kombiniert verschiedene Eigenschaften, die es einzigartig machen⁴: Die Verwendung von magnetischen Nanopartikeln als Immununterstützung reduziert die Gesamttestzeit von Stunden auf Minuten; Die Verwendung eines fluorogenen Enzyms für den Nachweis ermöglicht Nachweisgrenzen, die mit denen von Standard-Enzym-gebundenen Immunassays (ELISAs) vergleichbar sind. und die Verwendung eines Thermoplasts als Herstellungsmaterial macht es kompatibel mit der Massenproduktion, was bei den magnetischen Fallen früherer mikrofluidischer Nanopartikel nicht der Fall war³, und macht es zu einem ausgezeichneten Kandidaten für die Entwicklung von POCT.