ヒト人工多能性幹細胞由来2型肺胞上皮細胞の3Dスフェアおよび2D気液界面培養物の生成

ヒトiPSC株の分化を含むすべての実験は、ボストン大学の治験審査委員会(プロトコルH33122)に準拠して実施した。iPSCへのリプログラミングのために調達された皮膚線維芽細胞は、ワシントン大学医学部(ミズーリ州セントルイス)のヒト研究保護室の承認の下、書面によるインフォームドコンセントでドナーから入手した。 1. 肺胞圏解離 表1に記載の組成に従って完全無血清分化培地(cSFDM)を調製した。 表2に従って、調製したcSFDMベースにCK+DCIメディアを準備する。 実験ニーズに応じて、2D(ヒト胚性幹細胞認定)および/または3D(成長因子低減)マトリックスを氷上で融解する。 指向性分化19に由来する肺胞球を含む3Dマトリックス液滴から、ピペットまたは吸引ピペットを用いて真空ですべてのCK+DCI培地を12ウェルプレートに吸引する。 液滴あたり1 mLのディスパーゼ(2 mg/mL)を加える。液滴をP1000ピペットを用いてディスパーゼに穏やかにピペットする。37°Cで1時間インキュベートし、30分後に上下に1回ピペッティングする。 解離したオルガノイド(ステップ1.5から)をディスパーゼ内の1つのマトリックス液滴から15mLの円錐管に移す。洗浄するには、10mLのIscoveの改変ダルベッコ培地(IMDM、 材料表を参照)を加えます。 300 x g で室温で5分間遠心分離する。上清をピペットまたは吸引ピペットを使用して真空で吸引し、上清をできるだけ残さないでください。注:残りのディスパーゼは、細胞がその後に播種されるマトリックスを溶解する可能性があるため、すべてのディスパーゼを除去することが重要です。ペレットの上に明確なヘイズが見られる場合、ディスパーゼはマトリックスを完全に溶解しておらず、さらにディスパーゼを37°Cでさらに20〜30分間ペレットに添加することができる。 細胞を液滴あたり0.05%トリプシン1mLに再懸濁し、12ウェルプレートに戻した。37°Cで12〜15分間インキュベートする。解離を顕微鏡で観察する。この段階でセルを過剰にピペッティングすることは避けてください。注:インキュベーションの終わりに、細胞はP1000ピペットで3〜5回ピペッティングした後、単一細胞懸濁液を達成する必要があります。iAT2sをALIに継代する場合(ステップ3)、細胞培養インサートへのプレーティングの準備ができたら、細胞が単一細胞懸濁液ではなく2〜3細胞凝集塊になるように、トリプシン処理時間を最小限に抑える必要があります(最大12分)。 等量のFBS含有培地(DMEM中の10%ES修飾FBS)を用いてトリプシンの作用を停止する。300 x g で室温で5分間遠心分離する。 細胞を10mLのIMDMで洗浄する。300 x g で室温で5分間遠心分離する。 計数のために細胞を適切な体積に再懸濁し、次いで血球計数器を用いて細胞を計数する( 材料表を参照)。注: 400 cells/μL で播種された 1 つのコンフルエントな 50 μL マトリックス液滴から、期待される収量は 1 液滴あたり 500,000 ~ 1.5 x106 細胞です。 iAT2細胞の単一細胞懸濁液を使用して、3Dマトリックスにプレーティング(ステップ2)および/またはALI培養用の細胞培養インサートにプレーティング(ステップ3)することによって肺胞スフェアを生成します。 2.3D iAT2のめっき カウント後(ステップ1.11)、3Dマトリックスにリプレートする所望の細胞数を決定します(12ウェルプレートのウェルあたり50〜100μLの3Dマトリックス液滴を含むマトリックスの400細胞/μL)。細胞を300 x g で室温で5分間遠心分離する。ピペットを使用してできるだけ多くの上清を除去します。 3D マトリックス内のセルを再懸濁します。必要に応じて、マトリックスが重合するのを防ぐために、素早く氷の上に再懸濁します(これは暖かいときに起こります)。 P200ピペットを使用して、ウェルごとに1つの3Dマトリックス液滴を事前に温めた12ウェルプレートに分配します。ピペットは、マトリックス液滴中に気泡を生じさせないように注意深くする。複数の液滴を分配している間、細胞懸濁液が沈降しないようにしてください。 プレートを37°Cのインキュベーターに20〜30分間置き、マトリックス液滴が重合できるようにします。 1 ウェルあたり 1 mL の CK + DCI + 10 μM の Y-27632 培地 ( 材料表を参照) を加えて、マトリックス液滴を覆います。 72時間後、培地を10μMのY-27632を含まないCK+ DCIに変更する。 培地を48〜72時間ごとに新鮮なCK + DCIに交換してください。注: iAT2 は通常、細胞株およびプレーティング密度に応じて、約 10 ~ 14 日ごとに継代する必要があります。 3. iAT2 の ALI への受け渡し 2Dマトリックスの製造元の指示に従って、ダルベッコの改変イーグル培地/栄養素混合物F-12(DMEM/F12)で2Dマトリックスを作業溶液に希釈することにより、使用の1時間前にコーティングしたばかりの6.5mm細胞培養インサートを準備します( 材料表を参照)。次いで、6.5 mm細胞培養インサートあたり100 μLの希釈マトリックスを加える。マトリックスを37°Cのインキュベーター内で30分間または室温で1時間重合させます。 細胞培養インサートから余分なマトリックスをピペットまたは吸引ピペットを使用して真空で吸引し、DMEM/F12で1回すすいでください。細胞を加える直前にこの洗浄液を吸引する。 カウント後、培養インサート内の所望の細胞数を播種するために必要な細胞数を決定します(520,000生細胞/cm2、6.5 mm細胞培養インサートあたり172,000個の生細胞に相当)。細胞を300 x gで室温で5分間遠心分離する。できるだけ多くの上清を取り除きます。 細胞を適切な容量で再懸濁し、細胞培養インサートあたり100 μLのCK + DCI + 10 μM Y-27632を播種する(細胞懸濁液は1,720細胞/μLにする必要がある)。細胞培養インサートの頂端区画に100μLを加える。プレートをクロスパターンで穏やかに攪拌して、細胞培養インサート全体に細胞が均一に分布していることを確認し、4倍の対物レンズで顕微鏡下で確認することでこれを確認します。注: 播種密度は重要であり、6.5 mm 細胞培養インサートあたり 160,000 ~ 300,000 個の細胞の範囲で最適化が必要な場合があります。カルセイングリーン( 材料表を参照のこと)細胞透過性色素を細胞に添加し、播種後の細胞を可視化するために倒立蛍光顕微鏡で観察してもよい。 500 μLのCK+DCI + 10 μMのY-27632を各細胞培養インサートの側方区画に加える。 播種後48時間後に頂端CK+DCI+10μMのY-27632培地をピペットを用いて吸引し、ALIを開始した(「エアリフト」として知られる)。注: この時点で、セルは 100% コンフルエントである必要があります。セルが 100% コンフルエントでない場合、ステップ 3.7 ~ 3.8 は指示された時点で実行する必要があります。コンフルエントな細胞単層は、形成に時間がかかることがある。 72時間後に側底CK+DCI+10μMのY-27632培地を10μM Y-27632を含まないCK+DCIに変更する。注:頂端側への媒体の「漏れ」があれば、最小限に抑える必要があります。ただし、これが最初の数日間に発生した場合は、それ以上の漏れがなくなるまで毎日頂端側を吸引し続けます。 基底培地を48〜72時間ごとに新鮮なCK+ DCIと交換する。注: ALI 培養で使用される iAT2 は、めっき後 5 ~ 14 日で最大限に成熟します。 必要に応じて、めっき後最大28日間、細胞を注意深く監視して維持し、より長期間の実験を行います。注:インサートの端から細胞が剥離したり、単層に穴が開いたりするなど、ALI障害の目に見える兆候は、培養中の過度の延長時間後に観察され、その時点でALIはもはや実験に使用できなくなります。